熒光蛋白研究進(jìn)展

熒光蛋白研究進(jìn)展趙嫚學(xué)院：理學(xué)院班級(jí)：應(yīng)化0803班學(xué)號(hào)：2008310203907摘要：憑借在綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)研究領(lǐng)域取得的重要成就，3位科學(xué)家獲得了今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，他們分別是馬丁?查爾菲、錢(qián)永健和下村修。綠色熒光蛋白質(zhì)可以幫助科學(xué)家了解細(xì)胞機(jī)制如何工作。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，所有細(xì)胞和動(dòng)物都可以產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)?？的腋駥W(xué)院化學(xué)家、 《發(fā)光基因》作者馬克?齊默將綠色熒光蛋白質(zhì)稱(chēng)之為“21世紀(jì)的顯微鏡”。通過(guò)讓基因攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)——與瘤轉(zhuǎn)移或大腦功能有關(guān)的基因——科學(xué)家只需通過(guò)尋找熒光便可知道基因何時(shí)以及為什么“開(kāi)啟”。本文就GFP勺發(fā)現(xiàn)歷程、生化特性、及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用潛力進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。關(guān)鍵詞:熒光蛋白質(zhì)GFP諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)研究前景1、熒光蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介熒光蛋白質(zhì)為從發(fā)光生物中分離出的發(fā)光性蛋白質(zhì)。它不是蟲(chóng)熒光素、蟲(chóng)熒光酶那種酶蛋白質(zhì)催化所引起的發(fā)光，而是通過(guò)低分子物質(zhì)催化而發(fā)光的蛋白質(zhì)。水母的發(fā)光蛋白質(zhì)( aequorin)是通過(guò)Ca2+而發(fā)光的。海仙人掌類(lèi)的Renilla也含有同樣的發(fā)光蛋白質(zhì)。這種物質(zhì)包含在細(xì)胞內(nèi)顆粒中，這種顆粒稱(chēng)發(fā)光小體(lumisome)，發(fā)光蛋白質(zhì)所包含的發(fā)光物體是與海熒蟲(chóng)熒光素極為相近的物質(zhì)，因而推測(cè)，發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光與蟲(chóng)熒光素、蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)有著密切的關(guān)系。自1992年綠色熒光蛋白基因從水母體內(nèi)克隆以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)從很多的海洋生物物種中克隆到了新的熒光蛋白，它們能特異地“點(diǎn)亮”生物分子或細(xì)胞，并顯示出生物分子的活動(dòng)情況，從而能更有助于我們揭示這些分子或細(xì)胞的活動(dòng)規(guī)律及本質(zhì)。已報(bào)道的熒光蛋白光譜分布于整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)，它們被廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位與轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白折疊、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等研究領(lǐng)域，熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用為現(xiàn)代生物學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的研究手段。日籍科學(xué)家下村修(OsamuShimomura)首次從水母(Aequoreavictoria)中分離出綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein ,GFP,美籍教授查爾菲(MartinChalfie)首次將GFP的cDNA轉(zhuǎn)到新的物種中表達(dá)。美籍華裔科學(xué)家錢(qián)永健(RogerY.Tsien)率先闡述了GFP發(fā)光的化學(xué)機(jī)制，并于1995年通過(guò)單點(diǎn)突變(S65T)技術(shù)獲得了熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性大大增強(qiáng)的GFP突變體(GFP-S65T)。Tsien研究組基于GFP進(jìn)一步突變出了藍(lán)色熒光蛋白(bluefluorescentprotein,BFP)、青色熒光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)和黃色熒光蛋白(yellowfluorescentprotein ,YFP)。后來(lái)，研究人員又從珊瑚和?？任锓N中克隆出光譜紅移的熒光蛋白，極大地?cái)U(kuò)展了熒光蛋白的多色成像應(yīng)用。近幾年來(lái),科學(xué)家巧妙地將光活化與光轉(zhuǎn)換熒光蛋白應(yīng)用于高分辨成像,突破光學(xué)衍射極限，分辨率達(dá)到幾十納米，這是顯微成像技術(shù)史上的一次革命性的飛躍。這三位科學(xué)家因在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出貢獻(xiàn)而分享了 2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。他們的工作不但在科學(xué)上對(duì)化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義，而且也與人們的日常生活密切相關(guān)，對(duì)于提高人類(lèi)的生活品質(zhì)以及進(jìn)一步改善人類(lèi)的健康有十分重要的意義。2、研究GFP勺時(shí)間線索GF從最初被發(fā)現(xiàn)到今天廣為應(yīng)用， 經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間。首先簡(jiǎn)單回顧一下這半個(gè)多世紀(jì)內(nèi)和GFP目關(guān)的主要事件。1955年人們首次注意到水母體內(nèi)的綠色熒光物質(zhì)。1962年下村修從維多利亞多管水母中提取并分離了GFP，證實(shí)了綠色熒光物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。它的溶液在日光下略呈綠色，在白熾燈下略顯黃色，而在紫外燈下則發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。1969年之前稱(chēng)為綠色蛋白質(zhì)(greenprotein)得名“綠色熒光蛋白”。1974年研究發(fā)現(xiàn)光蛋白和GF兩種分子之間會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。1979年下村修找到了GFP中的生色基團(tuán)(Chromophore)1985年普臘石(DouglasPrasher)根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序拿到了光蛋白(水母素)的基因。1992年普臘石拿到了GFP勺基因。1993年GFP中生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)被確認(rèn)。1994年沙爾菲通過(guò)大腸桿菌和線蟲(chóng)研究獲得了GFP勺生色機(jī)理；是年，第一種藍(lán)色熒光蛋白被報(bào)道，并提到了它可用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET實(shí)驗(yàn)中。1995年研制出了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，它的轉(zhuǎn)錄速度比野生GFP快四倍。1996年得到了野生GF!和EGF的晶體結(jié)構(gòu)，錢(qián)永健在EGF的基礎(chǔ)上，禾U用突變技術(shù)，設(shè)計(jì)并研制出黃色熒光蛋白。1997年光蛋白和GFI被用于Ca2+勺敏感指示劑。1999年后各種各樣的熒光蛋白被發(fā)明、改造并用于科學(xué)研究。在研究GFP勺50多年間，2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的三位得主做出了至關(guān)重要的3、GFP勺生化性質(zhì)1962年,ShimomuraO等首次從多管水母屬(Aequoreavictoria)中分離純化出了GFP隨后人們對(duì)GF進(jìn)行了廣泛研究，目前研究得較為深入的是來(lái)自多管水母科(Aequorea)和海紫羅蘭科(Renilla)的熒光蛋白，即A—GF!和R-GFPA-GFP是分子質(zhì)量為27ku?30ku的蛋白單體，R—GFI是分子質(zhì)量為54ku的同型二聚體，二者都是酸性球狀蛋白質(zhì)，氨基酸組成目似，發(fā)射光譜基本目同，但激發(fā)光譜不同。A—GFI在395nm和470nm具有吸收高峰，F(xiàn)—GFI在498nm具有強(qiáng)烈的光吸收。只有完整的GF分子才會(huì)產(chǎn)生生物熒光，但與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP分子中一小段被稱(chēng)為色基(Chromophore)的部位。GF!用作標(biāo)記蛋白，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①熒光穩(wěn)定。 GF對(duì)光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長(zhǎng)時(shí)間的光照；GFI在pH7?12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對(duì)高溫(70C)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶Pronase除外)都有較強(qiáng)抗性。②檢測(cè)方便。用熒光顯微鏡或肉眼就可以觀察到，且可進(jìn)行活體觀察，不會(huì)損傷正在生長(zhǎng)的細(xì)胞和組織；③無(wú)種屬特異性，也沒(méi)有細(xì)胞種類(lèi)和位置的限制，ChalfieM等用PC方法擴(kuò)增GFPcDNA后，克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在紫外光照射下轉(zhuǎn)化細(xì)菌能發(fā)出綠色熒光；④GFP寸受體細(xì)胞基本無(wú)毒害；⑤不受假陽(yáng)性干擾。由于其他生物本身不含有 GFP因此不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，GF作為分子探針可以代替熒光染料避免由于染料擴(kuò)散造成的定位不準(zhǔn)，使結(jié)果真實(shí)可靠；⑥不需任何反應(yīng)底物和輔助因子；⑦可制成永久標(biāo)本。GFP勺熒光可以耐受光漂白，也可耐受福爾馬林的固定，因而可制成長(zhǎng)期保存的標(biāo)本；⑧靈敏度高。GF標(biāo)記方法比免疫組織化學(xué)方法具有更高的靈敏度和分辨率。盡管GF基因作為報(bào)告基因或分子探針有許多優(yōu)點(diǎn)，但野生型GF發(fā)光較弱，其次熒光反應(yīng)不是酶反應(yīng)，不能通過(guò)添加某些物質(zhì)來(lái)加強(qiáng)信號(hào)，且不易寸熒光進(jìn)行定量檢測(cè)。另一方面，GF基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)頻率并不高，甚至在某些植物細(xì)胞中并不表達(dá)。4、GFP勺應(yīng)用前景GF分子質(zhì)量小，能夠在異源細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)并發(fā)射熒光，不需要任何輔助因子參加，寸細(xì)胞沒(méi)有毒性，因而得到廣泛應(yīng)用。3．1作為報(bào)告基因構(gòu)建基因工程載體常用的質(zhì)?？寺≥d體的報(bào)告基因如LacZ,是利用酶促催化反應(yīng)，需要加人外源底物和誘導(dǎo)物(如IPTG,X—gal)，不僅操作繁瑣且價(jià)格昂貴?，F(xiàn)已構(gòu)建了以GFPS65T基因作為篩選標(biāo)記的新型克隆載體，建立了以綠白斑篩選法篩選陽(yáng)性重組子的新方法，替代LacZ藍(lán)白斑篩選，不需X-gal，經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)單可行。3．2目的基因的功能研究將目的基因與GF基因連接后，通過(guò)觀測(cè)融合蛋白的熒光特性研究其表達(dá)和功能。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)兩種DN拓?fù)涿?，該酶的N末端和中部結(jié)構(gòu)域序列高度保守，而其C末端結(jié)構(gòu)域(C—terminal-domain，CTD)具有種屬特異性。為了確定體內(nèi)核定位是否僅有CTD^與就可完成，將C末端基因與GF基因連接，并在GALI啟動(dòng)子驅(qū)使下在酵母細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)GF信號(hào)，發(fā)現(xiàn)兩種拓?fù)涿傅腃T陰得到表達(dá)，而且拓?fù)涿窾-GFP僅在細(xì)胞的有絲分裂期發(fā)現(xiàn)，拓?fù)涿窾-GFP主要出現(xiàn)于細(xì)胞分裂間期，結(jié)果說(shuō)明拓?fù)涿傅腃TBP足以充當(dāng)核定位的信號(hào)。3．3蛋白質(zhì)締合作用研究HaleCA等利用GF標(biāo)記，研究了可溶性微管蛋白FtsZ與其內(nèi)膜受體ZipA問(wèn)的締合作用，他們將GF與ZipA融合，并用FtsZ與之直接結(jié)合，通過(guò)熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZipA—GF融合蛋白在細(xì)胞壁縊縮前和縊縮過(guò)程中均位于FtsZ與膜相關(guān)的特殊環(huán)中，說(shuō)明ZipA—FtsZ的相互締合是細(xì)胞分裂必需的。ZipA可能直接參與FtsZ環(huán)的形成和功能。3．4病原體與宿主關(guān)系的研究將病原體用GF活體標(biāo)記，可以在全真條件而不是模擬條件下實(shí)時(shí)研究病原體與宿主的關(guān)系。將GF基因插人基因組，體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA并以之接種煙葉，觀察發(fā)現(xiàn)在接種點(diǎn)和整個(gè)植株均可表達(dá)GFP持續(xù)觀察GFP勺出現(xiàn)情況，發(fā)現(xiàn)整株感染時(shí)TMV以?xún)煞N方式運(yùn)動(dòng)：①細(xì)胞間慢的傳播，伴隨病毒復(fù)制的GF表達(dá)；②維管介導(dǎo)的快速轉(zhuǎn)運(yùn)，病毒不復(fù)制，GF不表達(dá)。5GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GF基因直接導(dǎo)入目標(biāo)生物或?qū)F基因克隆到病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒上，通過(guò)它們的介導(dǎo)而間接標(biāo)記目標(biāo)生物，進(jìn)行生態(tài)學(xué)規(guī)律研究。用 GF基因標(biāo)記遺傳工程微生物以監(jiān)測(cè)其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應(yīng)等構(gòu)建了帶 GF基因的重組棉鈴蟲(chóng)病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲(chóng)后不再重復(fù)感染，室內(nèi)飼養(yǎng)3代，各代均可見(jiàn)典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲(chóng)，表明病毒可以介導(dǎo)GF標(biāo)記其宿主，預(yù)計(jì)將為研究棉鈴蟲(chóng)的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強(qiáng)有力的手段。3.6GFP在生物防治中的應(yīng)用目前生物農(nóng)藥的殺蟲(chóng)效果往往得不到準(zhǔn)確評(píng)估。利用GF標(biāo)記，通過(guò)熒光觀察可以避免評(píng)估殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)效果時(shí)僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲(chóng)個(gè)體，而忽視無(wú)明顯感染癥狀但確實(shí)已經(jīng)感染或正在感染的害蟲(chóng)個(gè)體，同時(shí)無(wú)需進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲(chóng)劑致死和天然病原致死，從而客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)殺蟲(chóng)劑的毒力。3.7GFP乍為一種新型免疫標(biāo)記物的探索利用GFP勺發(fā)光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光從而可以直接觀察，可望取代傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)，建立特異、靈敏、簡(jiǎn)便和快速的免疫診斷新方法?，F(xiàn)已將 GF基因與豬圓環(huán)病毒的特定基因相連，進(jìn)行核酸定位，也成功地實(shí)現(xiàn)了GF基因與HBVeAg基因融合后在大腸埃希菌和昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)，得到既能發(fā)射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發(fā)光免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。5、問(wèn)題及展望盡管GFP能在藍(lán)光或長(zhǎng)紫外光的激發(fā)下，不需要任何反應(yīng)底物及其他輔助因子就能發(fā)出綠色熒光，但是檢測(cè)GF基因轉(zhuǎn)化材料時(shí)，如果背景熒光太強(qiáng)，熒光信號(hào)可能被背景信號(hào)所遮蓋，就很難檢測(cè)到熒光信號(hào)。在植物中，葉綠體和細(xì)胞壁是主要的自發(fā)熒光源，是構(gòu)成檢測(cè)熒光信號(hào)的主要障礙。在自發(fā)熒光較弱的情況下，通過(guò)調(diào)整光圈減少進(jìn)光量或選擇合適的濾光片就可以消除它們，從而突出GF熒光。隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，對(duì)GFP勺理論研究進(jìn)一步深入，并且GFP在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)一步加強(qiáng)，GF工程，包括GF蛋白工程和GF基因工程的迅速發(fā)展，尤其GF基因作為新型報(bào)告基因越來(lái)越受到關(guān)注，目前已經(jīng)應(yīng)用GF作為選擇標(biāo)記基因成功構(gòu)建多種表達(dá)外源基因的重組質(zhì)粒。但是在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些因素影響著GFP勺檢測(cè)。另外，在細(xì)胞生物學(xué)的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)新生GF通過(guò)折疊和加工成為具有活性的形式過(guò)程十分緩慢。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)GFP勺基礎(chǔ)理論研究的進(jìn)一步深入和新型突變體的不斷出現(xiàn)，有理由相信這些問(wèn)題終將得到解決，從而使GF更好地為科學(xué)研究服務(wù)。此外，新型光學(xué)成像技術(shù)（如飛秒激光快速隨機(jī)掃描雙光子顯微成像、高分辨光聲成像、超分辨顯微成像等）都迫切需要具備新特性的熒光分子與之相結(jié)合，以更大程度地提高成像的時(shí)空分辨率和檢測(cè)靈敏度。我們有理由相信，熒光蛋白在今后的生物學(xué)研究中能發(fā)揮更為重要的作用參考文獻(xiàn)：1、ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea.JCellCompPhysiol,1962,59:223~2292、HeimR,PrasherDC,TsienRY.Wavelengthmutationsandposttranslationalautoxidationofgreenfluorescentprotein.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:12501~125043、HeimR,CubittA,TsienRY.Improvedgreenfluorescene.Nature,1995,373:663~6644、ShcherboD,MerzlyakEM,ChepurnykhTV,FradkovAF,ErmakovaGV,SolovievaEA,LukyanovKA,BogdanovaEA,ZaraiskyAG,LukyanovS,ChudakovDM.Brightfar-redfluorescentproteinforwhole-bodyimaging.NatMethods,2007,4:741~7465、王曉麗，邵衛(wèi)星．綠色熒光蛋白研究進(jìn)展[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(1)：56~59．6、Stephaniec，Jean—DenisP，BrianI，M，etal-RecentAd—vancesinGFPfoldingreporterandsplit 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