基因表達(dá)（基因工程課件）

目的基因表達(dá)CONTENTS目錄01載體的概念、種類(lèi)02載體的條件、功能03質(zhì)粒基因表達(dá)概念基因表達(dá)和調(diào)控特點(diǎn)原核與真核生物基因表達(dá)的主要差異04基因表達(dá)過(guò)程0503影響外源基因表達(dá)的因素蛋白質(zhì)的表達(dá)形式基因表達(dá)：指基因攜帶的遺傳信息，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾等復(fù)雜過(guò)程，產(chǎn)生具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)過(guò)程?；虮磉_(dá)是受調(diào)控的基因表達(dá)和調(diào)控特點(diǎn)一、時(shí)間和空間特異性時(shí)間特異性(temporalspecificity)：某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按一定的時(shí)間順序發(fā)生?？臻g特異性(spatialspecificity)：多細(xì)胞生物個(gè)體在特定生長(zhǎng)發(fā)育階段，同一基因在不同的組織器官表達(dá)不同。二、基因表達(dá)的方式存在多樣性（一）基本/組成性基因表達(dá)：管家基因的表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在生物體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)或幾乎所有組織中持續(xù)表達(dá)。（二）誘導(dǎo)或阻遏表達(dá)有些基因的表達(dá)受到環(huán)境變化的影響誘導(dǎo)：在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)基因的表達(dá)增強(qiáng)的過(guò)程。阻遏：在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)基因的表達(dá)降低的過(guò)程。協(xié)同表達(dá)在一定機(jī)制控制下，功能相關(guān)的一組基因，無(wú)論其為何種表達(dá)方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達(dá)。三、順式作用元件和反式作用因子共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)順式作用元件：調(diào)節(jié)序列與被調(diào)控的基因位于同一條DNA鏈上。反式作用因子：調(diào)節(jié)序列遠(yuǎn)離被調(diào)控的基因，通過(guò)調(diào)節(jié)序列的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用，這些蛋白質(zhì)分子稱(chēng)為反式作用因子。四、基因表達(dá)調(diào)控是個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育的基礎(chǔ)通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)，以維持細(xì)胞分化與個(gè)體發(fā)育。通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)，使生物體表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以適應(yīng)環(huán)境，維持其生長(zhǎng)和增殖。原核生物與真核生物基因表達(dá)的主要差異

原核真核基因連續(xù)不連續(xù)基因組小，閉合環(huán)狀DNA分子大得多，染色質(zhì)重復(fù)序列很少多編碼基因/基因組大部分序列10%的序列mRNA多順?lè)醋訂雾樂(lè)醋舆z傳信息擬核DNA核DNA和線(xiàn)粒體DNA結(jié)構(gòu)基因表達(dá)單位操縱子為單位排列原核細(xì)胞中幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因常串聯(lián)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為多順?lè)醋?。真核mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)，為單順?lè)醋踊虮磉_(dá)過(guò)程一、轉(zhuǎn)錄原核生物每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱(chēng)為操縱子(operon)。操縱子包括若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。

啟動(dòng)子

操縱元件

調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因：表達(dá)調(diào)控蛋白，與操縱元件結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子:是RNA聚合酶和各種調(diào)控蛋白作用的部位。共有序列:在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-10及-35區(qū)域存在一些一致序列。-10區(qū)域：TATAAT，-35區(qū)域：為T(mén)TGACA

共有序列決定啟動(dòng)序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA分子攜帶幾個(gè)多肽鏈的編碼信息

多順?lè)醋印Ｔ鰪?qiáng)子：提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件需要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用與被調(diào)控基因位于同一條DNA鏈上是組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位不僅能夠在基因的上游或下游起作用，而且還可以遠(yuǎn)距離實(shí)施調(diào)節(jié)作用。沉默子：與特異蛋白因子結(jié)合時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。真核生物順式作用元件：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游有不同的DNA序列，這些序列的統(tǒng)稱(chēng)。順式作用：蛋白質(zhì)因子識(shí)別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)。反式作用：蛋白質(zhì)因子，與另一基因的順式作用元件作用，調(diào)節(jié)其表達(dá)。真核基因啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)周?chē)囊唤M轉(zhuǎn)錄控制組件，至少包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以及一個(gè)以上的功能組件。TATA盒：起始點(diǎn)上游多數(shù)有共同的TATA序列。通常認(rèn)為是啟動(dòng)子的核心序列。啟動(dòng)子上游元件：是位于TATA盒上游的DNA序列，多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)約-40～-100nt的位置，比較常見(jiàn)的是GC盒和CAAT盒。轉(zhuǎn)錄起始原核生物：RNA聚合酶和啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)RNA合成。RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合，形成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。

DNA雙鏈局部解開(kāi)，形成開(kāi)放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。真核生物：轉(zhuǎn)錄起始需要啟動(dòng)子、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與。真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子/轉(zhuǎn)錄因子/反式作用蛋白/反式作用因子，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)：?jiǎn)?dòng)子清除，σ亞基脫落，RNA聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移，在核心酶作用下NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。原核生物：在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)進(jìn)行（羽毛狀現(xiàn)象），轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。真核生物：轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。αβωαβ’σ核心酶全酶轉(zhuǎn)錄終止：RNA聚合酶在DNA模板上不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)。原核生物依賴(lài)ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止：ρ因子能與轉(zhuǎn)錄中的RNA結(jié)合,啟動(dòng)ρ因子ATP酶活性,并向RNA的3’端滑動(dòng),劃至RNA聚合酶附近時(shí),RNA聚合酶暫停聚合活動(dòng),停止轉(zhuǎn)錄。非依賴(lài)ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止：模板DNA在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)附近有特殊核苷酸序列，可以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，影響RNA聚合酶的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄終止。真核生物：轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn)：在讀碼框下游常有一組公共序列AATAAA及GTGTGT序列在超出讀碼框千百個(gè)核苷酸后停頓，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾。mRNA在A(yíng)ATAAA序列和序列GTGTGT間斷裂。加多聚腺苷酸（polyA）尾巴結(jié)構(gòu)。原核生物真核生物轉(zhuǎn)錄對(duì)比：二、翻譯以mRNA分子為模板，以tRNA為運(yùn)載工具，以20種氨基酸為原料，在核糖體內(nèi)生成相應(yīng)的氨基酸序列的過(guò)程。核糖體：蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所，在細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體中核糖體：rRNA和蛋白質(zhì)，直徑為20-25nm,真核細(xì)胞的核糖體比原核細(xì)胞的大。一)氨基酸的活化氨基酸的活化：氨基酸與特異tRNA結(jié)合形成氨基酰-tRNA的過(guò)程。原核生物：起始氨基酰-tRNA:

fMet-tRNAfMet

真核生物：起始氨基酰-tRNA:

Met-tRNAiMet參與肽鏈延長(zhǎng)的甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet二)肽鏈合成起始:原核生物30s小亞基與mRNA模板相結(jié)合再與fMet-tRNAfMet結(jié)合最后與50s大亞基結(jié)合真核生物40s小亞基首先與Met-tRNAiMet結(jié)合再與模板mRNA結(jié)合最后與60s大亞基結(jié)合生成起始復(fù)合物核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）----SD序列mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。原核生物肽鏈合成的延長(zhǎng)：進(jìn)位:

氨基酰-tRNA結(jié)合到核糖體A位。2.成肽:轉(zhuǎn)肽酶催化，P位上起始氨基酰-tRNA上的氨基酸與A位上氨基酰-tRNA的氨基形成肽鍵。3.轉(zhuǎn)位：轉(zhuǎn)位酶催化，A位的肽酰-tRNA移入P位。PAGGACAAACUAGGUUCCUGCUAG氨基酸1氨基酸2肽鏈合成終止核糖體A位出現(xiàn)mRNA的終止密碼子后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體大、小亞基等分離。原核生物：終止階段需要釋放因子RF-1、RF-2和RF-3參與，識(shí)別終止密碼子等功能真核生物：翻譯終止過(guò)程與原核生物相似，但只有1個(gè)釋放因子eRF。三、翻譯后修飾前體蛋白是沒(méi)有活性的，常常要進(jìn)行一個(gè)系列的翻譯后加工，才能成為具有功能的成熟蛋白。蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專(zhuān)一。蛋白質(zhì)行使正常生理功能所必需的。原核生物切除：切除N端甲酰甲硫氨酸和信號(hào)肽（多肽進(jìn)入質(zhì)膜需借助信號(hào)肽）糖基化：原核生物也存在糖基化；甲基化：較普遍，受體蛋白磷酸化：過(guò)程可逆，在細(xì)菌的趨化性和氮代謝過(guò)程中存在；乙?；航M蛋白、DNA結(jié)合蛋白、乙酰輔酶A合成酶、核糖體蛋白；類(lèi)泛素化：類(lèi)泛素蛋白存在，標(biāo)記蛋白并酶解蛋白真核生物切除：切除N端甲硫氨酸、信號(hào)肽、部分肽鏈（無(wú)活性

活性）；糖基化：普遍；羥基化：膠原蛋白、彈性蛋白磷酸化：過(guò)程可逆，涉及所有生理和病理過(guò)程（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等)；脂酰化：與脂類(lèi)共價(jià)連接，與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、形態(tài)發(fā)生等甲基化：賴(lài)氨酸、精氨酸上；乙?；航M蛋白乙?；龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，去乙?；种妻D(zhuǎn)錄；二硫鍵形成：分泌蛋白、膜蛋白泛素化：所有真核細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，對(duì)蛋白質(zhì)特異性水解影響外源基因表達(dá)的因素起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響1、起始tRNA可同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子2、但識(shí)別頻率不同，GUG=50%AUG；UUG=25%AUG3、從AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。密碼子密碼子生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性→使用頻率不同影響偏愛(ài)性的決定因素:1生物基因組中的堿基含量3細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量密碼子偏愛(ài)性對(duì)大腸桿菌中基因表達(dá)的影響原核生物和真核生物的密碼子使用頻率具有較大差異兩種方法可提高外源基因在大腸桿菌中表達(dá)：根據(jù)密碼子偏愛(ài)性合成外源基因同步表達(dá)基因表達(dá)所需的tRNA質(zhì)粒拷貝數(shù)

表達(dá)型質(zhì)粒在受體細(xì)胞中拷貝數(shù)可達(dá)數(shù)百至上千個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)增通常發(fā)生在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞代謝最旺盛質(zhì)粒過(guò)度增殖目的基因的高效表達(dá)

解決方法：控制重組質(zhì)粒擴(kuò)增影響受體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝重組質(zhì)粒不穩(wěn)定基因表達(dá)水平下降蛋白質(zhì)的表達(dá)形式包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在一定條件下，大腸桿菌能積累某種生物大分子。生物大分子致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為包涵體。包涵體形式的蛋白質(zhì)常喪失理化特性和生物學(xué)功能。包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵體形式表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的分離簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：包涵體水溶性差，密度大，菌體裂解后，通過(guò)高速離心可將重組蛋白從細(xì)菌裂解物中分離。一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)受體細(xì)胞的蛋白酶基本無(wú)法降解包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)。包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：包涵體內(nèi)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性、復(fù)性操作，才能得到具有正確空間構(gòu)象（具有生物活性）的目標(biāo)蛋白質(zhì)。分泌型異源蛋白的表達(dá)表達(dá)的異源蛋白，通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì),穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白質(zhì)產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。外膜內(nèi)膜分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。蛋白質(zhì)易于分離。蛋白質(zhì)末端完整：真核生物蛋白質(zhì)N端不含甲硫氨酸殘基★大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)，N端甲硫氨酸殘基不能被切除將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽序列重組，分泌表達(dá)后蛋白質(zhì)N端甲硫氨酸殘基在信號(hào)肽剪切過(guò)程中被有效除去。分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：★大腸桿菌的蛋白質(zhì)分泌機(jī)制不健全。★外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)★少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但表達(dá)效率比包涵體方式低很多。融合型異源蛋白質(zhì)表達(dá)★外源基因與受體細(xì)胞自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，由這種雜合基因表達(dá)的蛋白質(zhì)稱(chēng)為融合蛋白?！镌谌诤系鞍字?，受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)位于N端，異源蛋白質(zhì)位于C端?！锿ㄟ^(guò)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，從融合蛋白質(zhì)中釋放出目的蛋白質(zhì)。受體蛋白基因目的蛋白基因酶切位點(diǎn)或斷裂位點(diǎn)融合形式表達(dá)目的蛋