微生物溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑菌性分析

微生物溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑菌性分析

溶菌酶，又稱(chēng)異質(zhì)醇胞壁酶或多酚醛基總理酪氨酸酶，是一種堿性酶，能溶解細(xì)菌細(xì)胞中的糖苷含量，并能溶解微生物細(xì)胞。這是該酶的抗菌、消炎和抗菌作用。根據(jù)溶菌酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量和生物來(lái)源,可以將溶菌酶分為6種類(lèi)型,即:噬菌體T4溶菌酶(phage-type)、植物溶菌酶(plant-type)、微生物溶菌酶(bacteria-type)和3種動(dòng)物型溶菌酶,即溶菌酶C型(chicken-lysozymetype)、G型(goose-type)和I型(invertebrate-type)。目前已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用的溶菌酶多由蛋清中提取,其最適作用溫度為50℃,最適pH值為7.0,當(dāng)pH值在1.2～11.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí),依然能保持較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)。但該酶主要溶解革蘭氏陽(yáng)性菌,因而限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用,且國(guó)內(nèi)蛋清溶菌酶年產(chǎn)量不足50t,特別是高活性的溶菌酶供應(yīng)還不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求。微生物溶菌酶的研究和應(yīng)用尚處于起步階段,但因其較高的提取率、廣泛的溶菌譜和優(yōu)越的抑菌性,正日益受到研究人員的重視。微生物產(chǎn)溶菌酶主要有3種:N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、內(nèi)肽酶。在微生物的發(fā)酵液中往往存在許多溶菌作用相關(guān)因子,由于彼此之間的協(xié)同作用使其對(duì)細(xì)胞壁的溶菌能力增強(qiáng)。微生物溶菌酶純品為白色、微黃或黃色晶體或不定型粉末,無(wú)臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。本試驗(yàn)采用微生物來(lái)源的溶菌酶,通過(guò)對(duì)溶菌酶酶學(xué)性質(zhì)的研究及體外抑菌試驗(yàn),為溶菌酶在畜禽疾病治療、促進(jìn)生長(zhǎng)等方面的應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1微生物溶菌酶溶菌酶檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn));微生物溶菌酶(5000U/mg,上海沈李科工貿(mào)有限公司生產(chǎn));營(yíng)養(yǎng)瓊脂、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn))。1.1.2精密ph的測(cè)定UV-2000尤尼柯UNIC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);THZ-82水浴恒溫振蕩器;SE402F電子天平;PB-10精密pH計(jì);高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)、移液器等。1.1.3菌種菌種溶壁微球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏菌、沙門(mén)氏菌、啤酒酵母、黑曲霉及青霉均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。1.2測(cè)試方法1.2.1ph值對(duì)微生物酶的影響將0.1mol/L檸檬酸溶液和0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液按一定比例混合,分別配制成pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液;以無(wú)菌水配制1g/L的微生物溶菌酶溶液,進(jìn)行酶活測(cè)定。以其中的最高酶活為100%,其他條件下的酶活占最高酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。1.2.2ph值緩沖液下最適ph值緩沖液酶活測(cè)定調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋,分別設(shè)定反應(yīng)溫度為30、35、40、45、50、55、60、65、70℃,在最適pH值緩沖液下測(cè)定酶活,以最高酶活為100%,其他條件下的酶活占最高酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。1.2.3ph值緩沖液的制備稱(chēng)取1.000g溶菌酶,以對(duì)應(yīng)的最適pH值的緩沖液定容到1L,分別在40、50、60、70、80、90℃的水浴鍋中各預(yù)熱2支盛有1.9mL最適pH值緩沖液的試管。然后分別加入0.1mL的溶菌酶溶液,迅速搖勻并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)2min和5min,取出后迅速置于冰水浴中,于最適pH值和溫度條件下測(cè)定酶活,以未經(jīng)高溫處理的稀釋酶樣酶活為100%,其他條件下的酶活占未處理酶樣酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。1.2.4ph值對(duì)酶活的影響稱(chēng)取1.000g溶菌酶樣品,加入1L無(wú)菌水,攪拌均勻,在最適pH值和最適溫度條件下測(cè)定酶活作為對(duì)照。取0.1mL溶菌酶溶液(1g/L)12份,分別加入1.9mL的緩沖液,將pH值分別調(diào)到2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,于40℃水浴鍋中保溫2h,迅速取出放入冰水浴,分別于最適pH值和溫度條件下測(cè)定酶活。以對(duì)照組所測(cè)得的酶活為100%,其他條件的酶活占對(duì)照組酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。1.2.5微生物溶菌酶活性測(cè)定將各供試細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24h,啤酒酵母與霉菌孢子于液體土豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后,振蕩均勻,在無(wú)菌操作下,分別取150μL菌液與15mL固體培養(yǎng)基制成傾注平板,貼上滅菌的圓濾紙片。各取5μL濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1、1.5、2.0mg/mL的微生物溶菌酶溶液,滴加在濾紙片上,37℃培養(yǎng)24h,測(cè)定最低抑制濃度。每個(gè)菌種試驗(yàn)平行3次。2結(jié)果與分析2.1ph值對(duì)微生物溶菌酶活性的影響在37℃、不同pH值的緩沖液中測(cè)定的酶活見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,微生物溶菌酶隨著pH值的不斷增大,酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在pH值5.0～7.5之間可保持80%以上的酶活。而在pH值7.0左右的時(shí)候達(dá)到了最高峰,因此微生物溶菌酶的最適pH值為7.0。2.2反應(yīng)體系溫度對(duì)微生物溶菌酶活性的影響調(diào)整各個(gè)微生物溶菌酶溶液pH值為7.0,在不同溫度下測(cè)得的酶活變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可以看出,微生物溶菌酶的酶活隨著反應(yīng)體系溫度的上升,呈現(xiàn)了一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì),原因是起初溫度的上升加快了分子運(yùn)動(dòng),使反應(yīng)速度隨之提高,而達(dá)到40℃后,隨溫度的升高,溶菌酶逐漸失活,引起酶催化活性的下降。故該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。2.3in后酶活變化微生物溶菌酶溶液經(jīng)由不同溫度分別處理2min及5min后,酶活變化曲線(xiàn)如圖3。由圖3可以看出,微生物溶菌酶在濕熱處理2min后酶活基本不變,而濕熱處理5min后,溫度低于75℃時(shí),仍可保持80%以上的酶活。2.4酶活變化曲線(xiàn)微生物溶菌酶經(jīng)由不同的pH值條件處理2h之后,酶活變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。由圖4可以看出,在各pH值環(huán)境中處理2h后,微生物溶菌酶在pH值2.5～6.0左右的酶活,保持在100%以上,較穩(wěn)定。2.5革蘭陰性菌對(duì)微生物的抑制作用利用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定了不同濃度的微生物溶菌酶對(duì)8種細(xì)菌及3種真菌的最低抑制濃度(表1)。由表1可知,微生物溶菌酶不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用,對(duì)大腸桿菌、哈維氏菌、溶藻弧菌、沙門(mén)氏菌等陰性菌也具有很強(qiáng)的抑制作用,尤其是嗜水性氣單胞菌對(duì)該微生物溶菌酶最為敏感,最低抑制濃度為0.005mg/mL,而對(duì)副溶血弧菌較不敏感。此外,對(duì)啤酒酵母也有抑制作用,最低抑制濃度為2.0mg/mL。表明微生物溶菌酶具有廣譜抑菌性,并且對(duì)革蘭氏陰性菌(G-)具有比革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)更強(qiáng)的抑制效果。這可能是因?yàn)槲⑸锶芫概c革蘭氏陰性菌外層成分的脂多糖無(wú)親和性從而無(wú)法阻止溶菌酶的滲透,并且革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄,因而溶菌酶能很好地水解革蘭陰性菌細(xì)胞壁并抑制其生長(zhǎng)。此外,該微生物溶菌酶對(duì)啤酒酵母也具有一定的抑制效果,而對(duì)黑曲霉和青霉無(wú)抑制作用。3微生物溶菌酶的溫度及時(shí)間(1)微生物溶菌酶的最適作用pH值:溶菌酶隨著pH值的不斷增大,酶活是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在pH值5.0～7.5之間可保持80%以上的酶活,而在pH值7.0左右酶活達(dá)到最高峰。(2)微生物溶菌酶的最適作用溫度:溶菌酶的酶活隨著反應(yīng)體系溫度的上升呈現(xiàn)了一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì),到達(dá)40℃左右的時(shí)候酶活達(dá)到最高,超過(guò)40℃后酶活則開(kāi)始下降,該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。(3)微生物溶菌酶的濕熱穩(wěn)定性:微生物溶菌酶溶液濕熱處理2min后酶活基本不變,而濕熱處理5min后,溫度低于75