細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)范本

./細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)授課教師：毛曉霞〔一成績(jī)實(shí)驗(yàn)成績(jī)構(gòu)成分?jǐn)?shù)評(píng)分細(xì)則備注預(yù)習(xí)報(bào)告3分不全或未完成扣3分一實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒍?shí)驗(yàn)原理、三實(shí)驗(yàn)儀器與材料、四實(shí)驗(yàn)步驟、五注意事項(xiàng)課堂提問(wèn)2分答錯(cuò)一次扣2分一實(shí)驗(yàn)原理、二步驟、三注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果10分☆10分√8分,操作不規(guī)扣2分基本操作規(guī)、收拾試驗(yàn)臺(tái)實(shí)驗(yàn)報(bào)告15分一、容完整,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析透徹A+15分二、容完整A12分三、容構(gòu)成不完整B10分四、凡抄襲他人和被抄襲發(fā)現(xiàn)者一律C5分六實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析、七作業(yè)、八思考題1、實(shí)驗(yàn)占期末總成績(jī)30%,即30分；取七個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均成績(jī)?yōu)閷?shí)驗(yàn)最終成績(jī)2、分組：分AB兩班,每班5組,每組6人3、請(qǐng)假：輔導(dǎo)員簽字的假條+提前一天請(qǐng)假〔二實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一光學(xué)顯微鏡使用及顯微攝影技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)原理并熟練掌握其操作方法；2、掌握顯微攝影技術(shù)操作流程3、了解部分細(xì)胞生物學(xué)中所使用的大型儀器設(shè)備的操作流程及用途。二、實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡的放大效能是由其照明系統(tǒng)所使用光的波長(zhǎng)和透鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑?jīng)Q定,縮短使用的光波長(zhǎng)或增加數(shù)值孔徑可以提高分辨率。可見(jiàn)光的光波振幅較窄,因此使用較短波長(zhǎng)的紫外光作為光源系統(tǒng),可以提高分辨率。三、實(shí)驗(yàn)容1、雙目顯微鏡的操作規(guī)：2、NIKON80i顯微攝影系統(tǒng)的操作流程3、膠片放大洗印技術(shù)流程4、部分大型儀器設(shè)備介紹熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope相差顯微鏡微分干涉差顯微鏡倒置顯微鏡inversemicroscope顯微操作儀透射電子顯微鏡TEM四、作業(yè)1、雙目顯微鏡操作流程規(guī)五、思考題1、暗視野顯微鏡的定義與應(yīng)用2、相差顯微鏡的定義與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)二血涂片的制備及細(xì)胞大小的測(cè)量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆昭科闹苽浼夹g(shù)認(rèn)識(shí)血液中紅細(xì)胞和各類(lèi)白細(xì)胞的形態(tài)掌握目鏡測(cè)微尺的使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理：將血液樣品制成單層細(xì)胞的涂片標(biāo)本,經(jīng)瑞氏－吉姆薩染液染色后,不同白細(xì)胞中的顆?？梢猿尸F(xiàn)不同的顏色。堿性粒細(xì)胞的顆粒呈藍(lán)紫色,酸性粒細(xì)胞的顆粒呈7橘紅色,中性粒細(xì)胞的顆粒呈粉紅色。根據(jù)細(xì)胞中顆粒的顏色、大小及多少,再結(jié)合細(xì)胞的大小及細(xì)胞核的形態(tài),就可以將白細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)步驟〔一血涂片的制備1、消毒與取血

消毒

先按摩取血部位,使血流通暢;再用酒精消毒采血針和取血部位<如指尖>.

取血

待酒精干后,刺破皮膚,使血自然流出,勿擠.2、推片取一塊邊緣光滑的載片做推片.將其一端置于血滴前方,向后移動(dòng)到接觸血滴,使血液均勻分散在推片與載片的接觸處.然后使推片與載片呈30°～40°角,向另一端平穩(wěn)地推出,迅速在空氣中搖,使之自然干燥.

3、染色加瑞氏－吉姆薩A染液1－2滴,染色1分鐘,再將瑞氏－吉姆薩B染液滴加于A(yíng)液上面〔滴加之量為A液的2－3倍,染色5－10分鐘。最后用蒸餾水把染液沖掉,用吸水紙吸干,自然干燥后,即可鏡檢觀(guān)察4、觀(guān)察.四、注意事項(xiàng)玻片的清洗:使用玻片時(shí)只能手持玻片邊緣,切勿觸及玻片表面,以保持玻片清潔,干燥,中性,無(wú)油膩.

細(xì)胞染色對(duì)氫離子濃度十分敏感,在染色過(guò)程中玻片必須化學(xué)清潔,配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇,稀釋染液必須用緩沖液,沖洗用水應(yīng)近中性,否則各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常,致使細(xì)胞的識(shí)別困難,甚至造成錯(cuò)誤.

染色時(shí)間與染液濃度,室溫高低,細(xì)胞多少有關(guān).染液越淡,室溫越低,細(xì)胞越多,所需染色時(shí)間越長(zhǎng)或應(yīng)適當(dāng)增加染液量,因此染色時(shí)間應(yīng)視具體情況而定.特別是更換新染料時(shí)必須經(jīng)試染,摸索最佳染色條件.

染液不可過(guò)少,以防蒸發(fā)干燥染料沉著于血片上難沖洗干凈.沖洗時(shí)應(yīng)用流水將染液沖去,不能先倒掉染液,以免染料沉著于血片上.測(cè)微尺的使用顯微測(cè)微尺是用來(lái)測(cè)量細(xì)胞在顯微鏡下長(zhǎng)度的工具,由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺組成,兩尺配合使用.計(jì)算細(xì)胞、細(xì)胞核體積的公式：圓形V=4/3πr3<r為半徑>橢圓形V=4/3πab2<a、b為長(zhǎng)、短半徑>核質(zhì)比N／D=Vn／<Vc—Vn><Vn為核的體積,Vc是細(xì)胞質(zhì)的體積>五、作業(yè)題1、制備一血涂片,觀(guān)察并描述其中各類(lèi)血細(xì)胞的形態(tài)特征2、任選20個(gè)紅細(xì)胞,測(cè)量其直徑,并計(jì)算出平均值六、思考題從外觀(guān)來(lái)判斷,一好的血涂片有哪些特征？實(shí)驗(yàn)三細(xì)胞凝集反應(yīng)及細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的表面結(jié)構(gòu);了解細(xì)胞膜的滲透性及各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞膜的速度二、實(shí)驗(yàn)的原理

1.細(xì)胞凝集反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)膜是由蛋白質(zhì)不同程度鑲嵌在脂雙層中所形成的動(dòng)態(tài)流動(dòng)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)和脂類(lèi)分子又與寡糖鏈結(jié)合為糖蛋白和糖脂分子,糖蛋白和糖脂分子伸至細(xì)胞表面的分枝狀寡糖鏈在質(zhì)膜表面形成細(xì)胞外被〔又稱(chēng)為糖萼。凝集素〔1ectin是一類(lèi)含糖的〔少數(shù)凝集素例外并能與糖進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合的蛋白質(zhì),它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。凝集素促使細(xì)胞凝集主要是由于它能與細(xì)胞外被的糖分子相連接、在細(xì)胞間形成"橋"的結(jié)果,且加入與凝集素互補(bǔ)的糖分子可以抑制細(xì)胞間的凝集反應(yīng)。2.細(xì)胞膜的滲透性細(xì)胞膜<cellmembrane>:又稱(chēng)質(zhì)膜.細(xì)胞表面的一層薄膜.厚度通常為7～8nm,由脂類(lèi)和蛋白質(zhì)組成,還有一類(lèi)碳水化合物,我們知道糖類(lèi)物質(zhì)也屬于碳水化合物的圍。細(xì)胞膜把細(xì)胞包裹起來(lái),使細(xì)胞能夠保持相對(duì)的穩(wěn)定性,維持正常的生命活動(dòng).它最重要的特性是半透性,或稱(chēng)選擇滲透性,對(duì)進(jìn)出入細(xì)胞的物質(zhì)有很強(qiáng)的選擇透過(guò)性,它可以選擇性的讓某些分子進(jìn)入或排出細(xì)胞。這是細(xì)胞膜最基本的一種功能.如果細(xì)胞喪失了這種功能,細(xì)胞就會(huì)死亡.三、作業(yè)題〔1．繪制簡(jiǎn)圖,表示血細(xì)胞的凝集過(guò)程；〔2．圖示血細(xì)胞凝集的原理。試管編號(hào)是否溶血時(shí)間結(jié)果分析1>5ml氯化鈉+0.5ml稀釋雞血

2>5ml氯化銨+0.5ml稀釋雞血

3>5ml醋酸銨+0.5ml稀釋雞血

4>5ml硝酸鈉+0.5ml稀釋雞血

5>5ml草酸銨+0.5ml稀釋雞血

6>5ml硫酸鈉+0.5ml稀釋雞血

7>5ml葡萄糖+0.5ml稀釋雞血

8>5ml甘油+0.5ml稀釋雞血

9>5ml乙醇+0.5ml稀釋雞血

10>5ml丙酮+0.5ml稀釋雞血

四、思考題加入凝集素的細(xì)胞會(huì)凝聚在一起,加入何種物質(zhì)能抑制細(xì)胞凝集？實(shí)驗(yàn)四葉綠體的分離與熒光觀(guān)察一、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)、原理、操作方法二、熒光顯微鏡使用步驟光學(xué)觀(guān)察1．開(kāi)電源2．按預(yù)置開(kāi)關(guān).3．將ND8,ND32,NCB11減光片,色溫片移入光路4．推入光路轉(zhuǎn)換桿,使光路充滿(mǎn)雙目鏡筒5．轉(zhuǎn)動(dòng)激發(fā)方式轉(zhuǎn)換盤(pán)放空位處6．將聚光鏡升到最高位7．全部開(kāi)啟視場(chǎng)光闌和視場(chǎng)光闌〔使用1-100X聚光鏡時(shí),將頂透鏡置入光路8．將10X物鏡置于光路中9．放置標(biāo)本并將要觀(guān)察部分置于光路中10．對(duì)標(biāo)本調(diào)焦11．調(diào)節(jié)視度和瞳孔距離.12．聚光鏡聚焦和對(duì)中.13．轉(zhuǎn)換到所需的物鏡觀(guān)察標(biāo)本每次轉(zhuǎn)換物鏡時(shí),都要調(diào)節(jié)視場(chǎng)光闌和孔徑光闌〔視場(chǎng)光闌:調(diào)到剛好外切視場(chǎng)；孔徑光闌:物鏡數(shù)值孔徑〔N.A的70%至80%14．觀(guān)察完畢后,關(guān)閉電源.熒光觀(guān)察1．執(zhí)行"光學(xué)觀(guān)察"中的步驟1至11。2．降低聚光鏡或移開(kāi)聚光鏡并在它位置裝上遮光管。3．關(guān)閉顯微鏡電源開(kāi)關(guān)。4．關(guān)閉光閘和阻斷落射照明光組。5．將要使用的激發(fā)法相應(yīng)熒光塊移入光路。6．完全打開(kāi)落射照明裝置的視場(chǎng)光闌和孔徑光闌7．打開(kāi)落射照明裝置光源的電源開(kāi)關(guān)照后打開(kāi)光閘,對(duì)中照明燈8．將10X物鏡置入光路。9．放入標(biāo)本并將要觀(guān)察部分移入光路中。10．對(duì)標(biāo)本調(diào)焦。11．將落射熒光裝置的視場(chǎng)光闌對(duì)中心。.12．轉(zhuǎn)換到需要的物鏡并觀(guān)察標(biāo)本。*用落射熒光裝置的ND減光片調(diào)解亮度。*調(diào)節(jié)視場(chǎng)光闌使其剛好外切視場(chǎng)。*用孔徑光闌調(diào)節(jié)圖像亮度,使用孔徑光闌之前,先完成它的對(duì)中。*使用油浸物鏡時(shí),在標(biāo)本和物鏡間滴入浸油。13．回復(fù)到明場(chǎng)顯微術(shù)*關(guān)閉落射照明裝置的光閘并阻斷落射熒光光線(xiàn)。*旋轉(zhuǎn)激發(fā)法轉(zhuǎn)換盤(pán)將無(wú)熒光濾光塊的位置移入光路*如果沒(méi)有裝上聚光鏡裝上聚光鏡,然后進(jìn)行聚光鏡的對(duì)中和調(diào)焦〔參閱明場(chǎng)顯微術(shù)12節(jié)*打開(kāi)顯微鏡電源開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)到透射光源14．完成觀(guān)察后關(guān)掉所有電源開(kāi)關(guān)三、葉綠素的自發(fā)熒光和葉綠體的間接熒光原理某些物質(zhì)在一定短波長(zhǎng)的光〔如紫外光的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài),從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),就能在極短的時(shí)間放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光〔如可見(jiàn)光,這種光就稱(chēng)為熒光。若停止供能,熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體的物質(zhì)受激發(fā)光照射后,可直接發(fā)出熒光〔稱(chēng)為自發(fā)熒光,如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光,但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光〔稱(chēng)為間接熒光,如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光本實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡對(duì)發(fā)熒光的葉綠體進(jìn)行觀(guān)察。吖啶橙〔AcridineOrange,AO是一種熒光色素,其激發(fā)濾光片波長(zhǎng)488nm。阻斷濾光片波長(zhǎng)515nm。它與細(xì)胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別,可發(fā)出不同顏色的熒光〔即著色特異性,這是由于DNA是個(gè)高度聚合物,吸收熒光物質(zhì)的位置較少,發(fā)綠色熒光,而RNA聚合度低,能和熒光物質(zhì)結(jié)合的位置多,故發(fā)紅色熒光。四、作業(yè)題1、根據(jù)熒光觀(guān)察結(jié)果,繪制菜葉的結(jié)構(gòu)模式圖。2、概述濾鏡系統(tǒng)的選用原則。五、思考題1、分離細(xì)胞組分時(shí),為什么要加入0.35mol/L氯化鈉？實(shí)驗(yàn)五DNA的Feulgen染色一、Feulgen反應(yīng)的原理二、操作方法Carnoy液固定12h↓溫浴至60℃的1mol/LHCl溶液中水解8min↓蒸餾水沖洗3次〔使水解停止↓Schiff試劑中染色30min↓用漂洗液洗3~5次<以洗去多余的非特異性色素及擴(kuò)散的染料>↓蒸餾水洗3次↓壓片↓鏡檢三、作業(yè)題1、繪圖表示Feulgen反應(yīng)的染色結(jié)果四、思考題1、總結(jié)Feulgen反應(yīng)染色結(jié)果的影響因素。2、在稀鹽酸水解后,為什么要用亞硫酸水進(jìn)行洗片？實(shí)驗(yàn)六石蠟切片技術(shù)一、石蠟切片操作基本過(guò)程石蠟切片的制作過(guò)程主要包括：取材,固定,脫水,透明,透蠟,包埋,切片,貼片,染色,透明,封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量,無(wú)論取哪一種動(dòng)植物材料,以下幾點(diǎn)是必須注意的?！?植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動(dòng)物材料取用時(shí)常對(duì)動(dòng)物施以麻醉,常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,或?qū)?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織?！?取材必須新鮮,這一點(diǎn)對(duì)于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要,應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊,并隨即投入固定液?！?切取材料時(shí)刀要銳利,避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷?！?切取的材料應(yīng)該小而薄,便于固定劑迅速滲入部。一般厚度不超過(guò)2mm,大小不超過(guò)5×5mm2。2．固定固定劑的作用對(duì)象主要是蛋白質(zhì),至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作時(shí)不加考慮,如要觀(guān)察這些物質(zhì),可用特殊的方法將其固定下來(lái)。固定劑的作用表現(xiàn)在對(duì)材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對(duì)染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小,都依所固定的材料性質(zhì)而定,同樣一種固定液對(duì)某一材料來(lái)說(shuō)是良好的,但對(duì)另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快,能將細(xì)胞中的含物凝固成不溶解物質(zhì),不使組織膨脹或收縮以保持原形,硬化組織的程度適中,增加細(xì)胞含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存劑作用。固定劑有簡(jiǎn)單固定劑和混合固定劑的劃分。簡(jiǎn)單固定劑即單一的固定劑,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中,苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對(duì)這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。簡(jiǎn)單固定劑的局限性較大,如將其適當(dāng)混合,制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。固定時(shí),須注意以下幾點(diǎn)：〔1固定劑應(yīng)有足夠的量,一般為組織塊體積的10～15倍?！?如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì),可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,再移入水溶性的固定液?！?材料固定后如不立即下沉,可將其中氣泡抽出。〔4固定時(shí)間依材料大小、固定劑種類(lèi)而異,可從1小時(shí)到幾十小時(shí),有時(shí)中間需要更新固定劑。某些固定劑對(duì)組織的硬化作用較強(qiáng),作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制,不能過(guò)長(zhǎng)?！?一般固定劑都以新配制的為好,用過(guò)的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者,一定要在使用前才混合?！?固定完畢,根據(jù)所用固定劑的不同,用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,以免固定劑形成沉淀,影響以后組織塊的染色。3．脫水生物組織中含有大量的水分,它和石蠟是不能相溶的,致使在包埋時(shí)石蠟無(wú)法滲入組織部,因此須使用脫水劑將水分除盡,這就是脫水的作用。脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來(lái)進(jìn)行,一般組織從30％乙醇開(kāi)始,經(jīng)過(guò)50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對(duì)于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開(kāi)始。脫水時(shí)間依據(jù)組織的類(lèi)型和大小而定,一般各級(jí)乙醇中放置45min到1h,如果中間須停頓,應(yīng)使材料停留在70％乙醇中,因?yàn)榈蜐舛纫掖家资菇M織變軟、解體,高濃度乙醇有脆化組織作用,放置時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),另外,脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行,以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時(shí)停留其中,如需長(zhǎng)期保存,可加入等量的甘油。4．透明組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過(guò)透明。透明劑能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類(lèi)很多,較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快,透明力強(qiáng),但組織塊在其中停留過(guò)久,容易收縮變脆變硬,同時(shí)若脫水不凈,就會(huì)引起不良后果,在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液,再進(jìn)入純二甲苯,這樣可減少上述的缺點(diǎn)。透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定,—般各級(jí)停留時(shí)間在30min至2h,在純二甲苯中應(yīng)更換2次,總時(shí)間則以不超過(guò)3h為宜。材料經(jīng)過(guò)透明,會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何,若脫水徹底,組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài),如組織中有白色云霧狀,說(shuō)明脫水不凈,須返工處理,但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí),應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分,并保持其無(wú)水狀態(tài)。甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同,唯沸點(diǎn)較低,透明較慢,但不會(huì)使組織變脆。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟,熔點(diǎn)在50～60℃之間,應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時(shí)的氣溫條件來(lái)選用。一般動(dòng)物材料最常用的石蠟熔點(diǎn)為52～56℃,植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的,切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時(shí)選用52～54℃的石蠟可順利切片,冬季可用熔點(diǎn)46～48℃的石蠟,夏季可選56～58℃的。透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行,恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度,使經(jīng)過(guò)透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次,透蠟的時(shí)間依材料性質(zhì)而定,一般每次需15～30min。透明的關(guān)鍵是控制溫度的恒定,切忌忽高忽低,溫度過(guò)低石蠟?zāi)虩o(wú)法滲透,溫度過(guò)高使組織收縮發(fā)脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是:先準(zhǔn)備好紙盒〔具體折法見(jiàn)圖1-3及說(shuō)明,將熔蠟倒入盒,迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,再輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?使其迅速冷卻凝固,30min后取出。包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度,保證組織塊與周?chē)炌耆跒橐惑w。石蠟的迅速冷卻也很重要,否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶,以后切片時(shí)引起碎裂。6．切片〔1石蠟塊的固著與整修在包埋以后,就可進(jìn)行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤(pán),這也可用同樣大小的臺(tái)木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上,并使組織塊朝外,便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平,使上下兩面修成平行面,常保留組織周?chē)街鴮?～3mm的石蠟,而修好的蠟塊呈長(zhǎng)方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識(shí)別切片?！?切片機(jī)和切片刀切片機(jī)是用來(lái)作各種組織切片的一種專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的精密機(jī)械,常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī),它的夾物部分是上下移動(dòng)前后推進(jìn)的,而夾刀部分則固定不動(dòng)。主要部件是安裝切片刀的刀臺(tái)、安裝包埋塊的標(biāo)本臺(tái)和控制切片厚度的微動(dòng)裝置。切片時(shí)切片刀固定不動(dòng),轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪,標(biāo)本臺(tái)上下運(yùn)動(dòng)并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離,組織塊上下運(yùn)動(dòng)一次,便在刀片上得到一合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀,方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上,將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨,使用完畢后應(yīng)及時(shí)用二甲苯將石蠟油擦凈?！?切片方法切片前,將刀口置放大鏡下觀(guān)察,選擇刀口平整無(wú)缺刻的部分來(lái)進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺(tái)上,使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行,并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺(tái)推至外緣后松開(kāi)刀片夾的螺旋,上好刀片,使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角,包埋塊上下邊與刀口平行。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度,調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間,否則容易損傷切片機(jī),將刀臺(tái)移至近標(biāo)本臺(tái)處,讓刀口與組織切面稍稍接觸,這時(shí)就可以開(kāi)始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪,左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蠟帶,待蠟帶形成一定長(zhǎng)度后,右手停止轉(zhuǎn)動(dòng),持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,平放于襯有黑紙的紙盒,注意切片速度不宜太快,搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻,防止切片機(jī)震動(dòng)厲害引起切片厚薄不均勻,還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向,以防標(biāo)本臺(tái)后移而切不到片子。切片完畢,應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。7．貼片切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理,但是切片常有細(xì)小的橫紋,必須經(jīng)展平后才能貼附,否則影響染色和觀(guān)察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡(jiǎn)單,首先將切片分割開(kāi),投入到48℃的溫水浴中,這時(shí)切片都浮在水面上,由于表面力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液〔將雞蛋一個(gè)打破入杯中,去除蛋黃留下蛋白,用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫,然后用雙層紗布過(guò)濾至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一體積的麝香草酚〔thymol作防腐用,可保存幾個(gè)月到一年?；?％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。燙板法將涂有粘片劑的載玻片上涂上水,把已分割好的切片貼上去,再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干,并傾斜或用吸水紙吸去水分,最后將載玻片再度放燙板上晾干。要注意,不管是使用撈片法還是燙板法,所用的載玻片必須潔凈,不能有油污〔檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水,若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀,即表示載玻片不清潔,有殘留油脂等物在上面；切片的光面應(yīng)朝下,否則染色過(guò)程中切片容易脫落。8．染色組織切片是無(wú)色透明的,必須進(jìn)行染色后才能觀(guān)察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多,但是染色劑往往是水溶液,因此切片必須經(jīng)過(guò)脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水、透明的逆過(guò)程。由于切片十分菲薄,處理的時(shí)間大大減少,一般每級(jí)停留約2～5min。本次實(shí)驗(yàn)采用HE染色法。切片在二甲苯中脫蠟5～10分鐘。移入二甲苯和純酒精〔1∶1混合液中5分鐘左右〔如經(jīng)二次二甲苯脫蠟,此步可略。入100％、95％、85％、70％酒精,各級(jí)為2～5分鐘。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。木精染液染色5～15分鐘。水洗玻片上多余染液,0.5～1％鹽酸酒精〔70％酒精配制分色片刻。鏡檢控制,直至細(xì)胞核及核染色質(zhì)清晰為止,約數(shù)10秒鐘。流水沖洗15～30分鐘,或者在碳酸鋰飽和液中短時(shí)間堿化或藍(lán)化,即細(xì)胞核呈藍(lán)色。蒸餾水短洗。〔80.1～0.5％伊紅染液染色1～5分鐘,若著色困難,可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸,使易著色且不易脫色?！?依次經(jīng)70％、85％、95％、100％酒精脫水,各級(jí)為2～3分鐘,在95％以下濃度的酒精中伊紅易脫色,應(yīng)適當(dāng)縮短時(shí)間?！?0二甲苯透明〔二次,共約10分鐘9．透明染色后的切片須再次經(jīng)過(guò)脫水、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后,折射率改變,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地顯示出來(lái)。10．封藏封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,封藏劑必須能與透明劑互溶,對(duì)染色無(wú)影響,折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì),常用的封藏劑有加拿大樹(shù)膠和中性樹(shù)膠。封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在標(biāo)本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹(shù)膠,仔細(xì)覆蓋上蓋玻片,避免產(chǎn)生氣泡,也不得拖動(dòng)蓋玻片,以免將標(biāo)本破壞。樹(shù)膠量視蓋玻片大小而定,勿使過(guò)多過(guò)少。貼上標(biāo)簽,注明材料、染色法,待封藏劑凝固后便成為一成功的石蠟切片。二、掌握HE染色的基本原理和染色方法。三、作業(yè)題1、每人一石蠟切片,根據(jù)結(jié)果給分。四、思考題1、為什么說(shuō)石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)？2、恒溫在透蠟過(guò)程中有何作用？實(shí)驗(yàn)七電子顯微鏡技術(shù)一、透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)由電子光學(xué)系統(tǒng)〔簡(jiǎn)稱(chēng)鏡筒、真空系統(tǒng)、電子光學(xué)系統(tǒng)三部分組成。電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀(guān)察窗和記錄用的照相機(jī)等組成。透射電鏡的鏡筒是由電子槍、6～8級(jí)電磁透鏡〔electronmagneticlenses及一些光路元件組成的密閉圓筒,可以控制電子束的形狀和發(fā)射強(qiáng)度,是透射電鏡的核心。電子槍發(fā)射電子波作為"光源",而電磁透鏡則能控制電子的軌道,因?yàn)殡娮邮菐щ姷?所以電磁透鏡能夠改變電子束的方向。在透射電鏡中有五個(gè)電磁透鏡,根據(jù)每個(gè)磁場(chǎng)的功能并沿用光鏡的稱(chēng)謂習(xí)慣,自上而下依次稱(chēng)為：第一和第二聚光鏡、物鏡、中間鏡〔2～3級(jí)和投影鏡。樣品置于末級(jí)聚光鏡和物鏡之間。觀(guān)察室和照相室在投影鏡下方。透射電鏡有龐大的供電系統(tǒng)和真空系統(tǒng),其中真空系統(tǒng)是用兩種類(lèi)型的真空泵串聯(lián)起來(lái),從而獲得電鏡鏡筒中的真空,當(dāng)電鏡啟動(dòng)時(shí),第一級(jí)旋轉(zhuǎn)式真空泵獲得低真空的二級(jí)采用油擴(kuò)散播泵而獲得高真空。AB圖1A普通光學(xué)顯微鏡B透射電子顯微鏡二、透射電鏡的基本工作原理一般生物樣品的透射電鏡圖像,可以用"質(zhì)量－厚度"〔mass-thickness,ρt反差成像原理作簡(jiǎn)單描述。電鏡的鏡筒建立強(qiáng)加速場(chǎng),生物樣品常采用60～100kV的加速電壓。電子槍陰極發(fā)射出的電子在加速場(chǎng)中獲得速度和能量,足以透射過(guò)50～70nm厚的生物樣品并使之成像。聚光鏡使來(lái)自電子槍的電子束聚焦,并常以散焦的狀態(tài)泛光式地照射在樣品上。此時(shí),入射電子束與樣品原子之間相互作用發(fā)生一種物理現(xiàn)象——電子散射〔electronscattering。在電子散射過(guò)程中,大部分電子直接透過(guò)樣品,稱(chēng)為直接透射電子〔transmissionelectron,TE；有一部分電子在穿透樣品過(guò)程中不僅改變運(yùn)動(dòng)方向,而且可能還損失能量,這些TE稱(chēng)為彈性或非彈性散射電子〔elasticallyscatteredelectrons,inelasticallyscatteredelectrons。樣品結(jié)構(gòu)的"質(zhì)量—厚度"〔ρt越高,元素的原子序數(shù)越大,電子散射越強(qiáng),TE中的直接透射電子越少,而彈性或非彈性散射電子越多。樣品下方設(shè)計(jì)了一個(gè)30～80μm的小孔稱(chēng)"反差光闌"〔contrastaperture,攔截〔吸收掉散射強(qiáng)的電子,而使直接TE及部分弱散射電子通過(guò)。這樣,能通過(guò)光闌進(jìn)入成像系統(tǒng)的TE就帶有樣品上的微細(xì)結(jié)構(gòu)信息了。相對(duì)ρt高的結(jié)構(gòu)區(qū)域,電子散射強(qiáng),能通過(guò)"反差光闌"進(jìn)入成像系統(tǒng)的TE少,反之,則多。這些TE經(jīng)過(guò)幾級(jí)成像透鏡的放大,由末級(jí)投影鏡投射到觀(guān)察室熒光屏上,激發(fā)熒光屏發(fā)出可見(jiàn)光。TE多,熒屏亮,TE少,熒屏暗。屏點(diǎn)的亮暗程度一一對(duì)應(yīng)著樣品微細(xì)結(jié)構(gòu)ρt的高低。這樣,生物樣品的透射電子顯微圖就形成了,其圖像分辨率〔resolution比透射電鏡的分辨本領(lǐng)〔resolvingpower差一個(gè)數(shù)量級(jí)。事實(shí)上,透射電鏡成像機(jī)制比上述復(fù)雜得多,尤其對(duì)原子尺度的透射電子顯微成像,則必須用波的傳輸理論解釋,相關(guān)理論和技術(shù)屬于高分辨率電子顯微學(xué)的疇,不在此討論。三、使用操作程序1打開(kāi)電源,抽真空。2照明系統(tǒng)〔電子槍+聚光鏡合軸。3取放樣品。4加速電壓選擇、物鏡光闌選擇、觀(guān)察區(qū)域選擇、放大倍數(shù)選擇、圖像聚焦及拍照記錄。5關(guān)機(jī)操作。四、透射電子顯微鏡樣品制備1、試劑配制10.2mol／LPBS：A液：磷酸氫二鈉〔Na2HPO4·2H2O35.61g加雙蒸水溶解至1000ml。B液：磷酸二氫鈉〔NaH2PO,·2H2O31.21g加雙蒸水溶解至1000ml。根據(jù)不同要求,按不同配比,可得不同pH值的0.2mol／L的PBS,見(jiàn)下表：表2-1不同配比的PBS的pH值pH〔257.07.27.47.6A液〔mlB液〔ml30.519.536.014.040.59.543.56.522.5％戊二醛〔C5H8O2固定液：25％戊二醛10ml,0.2mol/LPBS50ml,加雙蒸水40ml。31％四氧化鋨〔OSO4固定液。2％貯存液：取1gOSO4安瓿泡酸48h,沖洗48h,雙蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻劃1～2道痕,置入棕色磨口瓶,加雙蒸水50ml,用力搖動(dòng)使安瓿破碎。靜置48hOSO4溶解后備用。4℃1％使用液：取2％OsO4貯存液10ml,加0.2mol/LPBSl0ml混合。4不同濃度的乙醇溶液：用無(wú)水乙醇稀釋成90％、80％、70％、60％、50％的乙醇。590％丙酮用無(wú)水丙酮稀釋。6環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑〔Luft配方：A液：Epon812612ml,DDSA10ml。B液：EpOn81210ml,MNA8.9ml。使用時(shí)根據(jù)不同硬度要求按一定比例〔1:1～1:9混合,A液多,則軟。AB液混勻后,逐滴加入DMP-30,其濃度控制在1％～2％。邊加邊攪,充分?jǐn)嚢?0min左右。7醋酸鈾染液：醋酸雙氧鈾UO2〔C2H3O22·2H2O〔Uraniumacetate溶于50％～70％乙醇溶液中至飽和,靜置1～2天,使未溶的部分沉淀,取上部黃色透明溶液用,避光保存。8枸櫞酸鉛溶液：A液：硝酸鉛[Pb〔NO32]〔必須為新近產(chǎn)品1.33g,枸櫞酸鈉〔Na3C6H5O7·2H2O1.76g,雙蒸水〔用前加沸冷卻30mlB液：氫氧化鈉〔NaOHlmol／L。使用液：A液配制完畢30min后,加B液8ml,加雙蒸水至50ml混勻,溶液清亮〔pH12。如有沉淀,離心后再用。最多保存半年。2、超薄切片制備1取材將動(dòng)物處死后,要快速取出組織,以免細(xì)胞部細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。取材過(guò)程要注意以下幾點(diǎn)：①取材部位要準(zhǔn)確；②無(wú)人工損傷,不要牽拉、擠壓,⑧樣品塊要小,一般切成lmm3的小塊,起碼在某一個(gè)方向上的厚度要小于lmm,④組織離開(kāi)活體后盡快〔1min之進(jìn)入預(yù)冷的戊二醛固定液中〔4℃保存。2固定固定是電鏡樣品制備中最重要的一環(huán),其目的是使細(xì)胞生命過(guò)程立即終止,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持生前狀態(tài)。電鏡材料固定一般采用雙重固定法,即先用戊二醛進(jìn)行前固定,然后再用鋨酸進(jìn)行后固定。兩次固定之間要進(jìn)行漂洗。〔1前固定：將取的材料立即投入預(yù)冷的25％戊二醛溶液中,4℃條件下固定3h。若不馬上進(jìn)行后面的制備程序,可保存在0.2mol/L的PBS中或2.5％戊二醛溶液固定液中〔4℃。說(shuō)明：戊二醛〔C5H8O2分子量為100.12,是一種五碳雙醛,市售濃度多為25％水溶液,無(wú)色透明,pH4.0～5.0。氧氣、高溫、中性或堿性均可使其失去醛基,應(yīng)低溫、密封保存。兩個(gè)醛基與蛋白質(zhì)、核酸等的氨基發(fā)生交鏈作用,可以較好地固定蛋白質(zhì)、核酸和多糖等,能保存微管、糖原、核蛋白和細(xì)胞基質(zhì)等,不易使酶失活,可以用于細(xì)胞化學(xué)研究,但不能固定脂類(lèi),對(duì)脂質(zhì)顆粒、膜結(jié)構(gòu)等保存不好。如果對(duì)保存超微結(jié)構(gòu)〔尤其膜系統(tǒng)有較高的觀(guān)察要求,經(jīng)戊二醛溶液?jiǎn)喂潭ǖ臉悠凡灰吮４孢^(guò)長(zhǎng)時(shí)間,在1周進(jìn)入常規(guī)制備程序?yàn)楹谩?.5％的戊二醛固定液對(duì)組織的平均滲透深度為0.6mm,這是取材要小的原因之一。〔2鋨酸后固定：進(jìn)行后固定以前,材料要用0.02mol／LPBS漂洗3次,每次l0min。避免戊二醛與OSO4發(fā)生氧化還原反應(yīng),生成沉淀,所以要徹底洗干凈。漂洗后取出,轉(zhuǎn)入1％OSO4固定液中,4℃條件下固定1～2h。說(shuō)明：四氧化鋨〔OSO4分子量254.2,呈淡黃色結(jié)晶,其水溶液呈中性。對(duì)氮有較強(qiáng)的親和力,能與蛋白質(zhì)氨基迅速結(jié)合形成交鏈化合物,對(duì)含蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)成分均能固定。能與不飽和脂肪酸反應(yīng),生成四氧化鋨二酯化合物,使含有脂類(lèi)的結(jié)構(gòu)固定。因?yàn)殇~是一種高原子序數(shù)元素,在用OSO4固定樣品的同時(shí),還起到一種電子染色作用。但是,OSO4不能固定核酸,對(duì)糖原、微管等保存不好。同時(shí),OSO4又是酶的鈍化劑,不能用于細(xì)胞化學(xué)研究。OSO4固定時(shí)間太長(zhǎng),不僅易丟失成分,而且會(huì)使組織變脆,難切片。OSO4具有極強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性,在任何污染和光照條件下,都可能還原成水和二氧化物而減弱固定效果,故不易長(zhǎng)期保存,呈棕色或黑色時(shí),均被認(rèn)為。1％OSO4固定液對(duì)組織的滲透深度比戊二醛還差,有實(shí)驗(yàn)證明僅在0.25～0.5mm深度有迅速均勻的固定,稍大的組織易形成固定梯度。3脫水〔1將OSO4固定后的材料取出,在脫水以前要進(jìn)行漂洗。先用吸水紙吸干凈OSO4固定液之后,用0.2mol／L的PBS漂洗3次,每次10min。以避免在脫水時(shí)OSO4與乙醇產(chǎn)生氧化還原反應(yīng),生成沉淀,所以要徹底洗干凈?！?將漂洗后的材料依次放入50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、90％乙醇與90％丙酮的1:1混合液、100％丙酮,每級(jí)15～20min,使組織中的水分充分除去。說(shuō)明：脫水劑一般用乙醇、丙酮和環(huán)氧丙烷等,利用它們具有能與水也能與包埋劑混溶的特點(diǎn),以取代樣品中的水分,使水分充分除去。濃度梯度脫水是為了減少樣品收縮。4浸透經(jīng)脫水后的材料在包埋以前要經(jīng)過(guò)浸透處理,即用包埋劑與脫水劑按濃度梯度分級(jí)換液,使包埋劑逐漸取代脫水劑滲透到組織中去,最終使組織細(xì)胞所有空隙均充滿(mǎn)包埋劑。具體操作方法：在室溫下或37℃條件下將樣品置入3:1的100％丙酮溶液與包埋劑的混合液,10～30min；1:1的100％丙酮溶液與包埋劑混合液,30～60min；1:3的100％丙酮溶液與包埋劑混合液,1～2h或過(guò)夜；純包埋劑,2～5h或過(guò)夜。5包埋包埋的目的是讓樣品材料獲得一定的硬度、彈性和韌性,以便制成超薄切片。操作過(guò)程如下：在包埋模具滴一滴包埋劑,把樣品置入并使之定位于合適位置〔依模具而異,緩緩注入包