引物合成常見問題

引物合成常見問題Q1.引物是如何合成的？目前引物合成大體采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種，無論采用什么機械合成，合成的原理都相同，主要不同在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)歷時的多少。⑴去保護：加入Deblocking脫去堿基上5'-OH的保護基團DMT，取得游離的5'-OH;⑵耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基5'-OH仍然被DMT保護，3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發(fā)生耦合反映；封鎖：耦合反映中極少數(shù)5'-OH沒有參加反映，用封鎖試劑終止其后繼續(xù)發(fā)生反映；氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩(wěn)固的核苷磷酸酯。Q2.引物合成如何處置？切割與脫保護基:將合成好的寡核苷酸鏈從支持物上化學切割下來。常常利用新鮮的濃氨水來裂解CPG與初始核苷之間的酯鍵。斷裂下來的寡核苷酸帶有自由的3'羥基。純化：按照所合成寡核苷酸的組成和應用來選定純化的方式。常常利用的純化方式有：C1八、OPC、PAGE和HPLC。定量：按照寡核苷酸在260nm處的紫外吸收來定量。貯存：分裝抽干。Q3.合成的弓I物5'端是不是有磷酸化？合成的引物5'為羥基，沒有磷酸基團。若是需要您能夠用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或要求咱們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。Q4?需要什么級別的引物？按如實驗需要，肯定訂購引物的純度級別。應用引物長度要求純度級別要求一般PCR擴增<60baseHEPD>60basePAGE診斷PCR擴增<40baseHEPDpageDNA測序20base左右HEPD亞克隆，點突變等根據(jù)實驗要求疋HEPDPAGE，HPLC基因構(gòu)建(全基因合成)根據(jù)實驗要求疋HEPDPAGE反義核酸根據(jù)實驗要求疋HEPDPAGE修飾引物根據(jù)實驗要求疋PAGE,HPLCQ5?需要合成多少OD數(shù)?按如實驗目的肯定。一般PCR擴增，2OD引物，能夠做500-1000次50ul標準PCR反映。若是是做基因拼接或退火后做連接，1OD就足夠了。Q6.如何計算引物的濃度？弓I物保留在高濃度的狀況下比較穩(wěn)固。一般情形下，咱們建議將引物的濃度配制成100pmol/ul,稱為保留濃度，而引物的工作濃度一般配制成10-50pmol/u1。加水的體積(微升)可直接參照合成報告單上推薦的體積，也可按下列方式計算：V(微升)=OD數(shù)x33x10000/引物的分子量引物的分子量能夠從合成報告單上取得。注意：1OD260=33ug/m1。溶解前您需要查對合成報告單和引物標簽上的引物OD數(shù)是不是一致。若是不一致，請和咱們聯(lián)系。咱們能夠按照生產(chǎn)記錄查到實際產(chǎn)量是多少。Q7.如何計算引物的Tm值？引物設計軟件都能夠給出Tm,與引物長度、堿基組成及所利用緩沖夜的離子強度有關。長度為25base以下的引物，Tm計算公式為：Tm=4°C(G+C)+2°C(A+T)對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm= +xLog10[Na+]+ (GC%)-600/size**公式中，Size二引物長度。Q8.引物(含修飾)的分子量是如何肯定的？非修飾的引物的分子量(MW)在隨引物提供的報告單上能夠找到。若是需要估量一個引物的分子量按每一個堿基的平均分子量為，引物的分子量=堿基數(shù)x堿基的平均分子量，或按下列公式計算MW=(NA*WA)+(NC*WC)+(NG*WG)+(NT*WT)+(Nmod*Wmod)+(Nx*Wx)+(NI*WI)+16*Ns-62.NA,NG,NC,NT,NI別離為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA,WG,WC,WT,WI別離為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod別離為修飾基團的數(shù)量和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為(+)/2=。Ns為硫代數(shù)量，

硫代每一個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量BaseMolecularWeightACGTIU常規(guī)修飾基團分子量5'-Biotin3'-TAMARA5'-(6FAM)3'-Dabsyl5'-HEX3'-(6FAM)5'-TET3'-AminoModifierC35'-Cy53'-AminoModifierC75'-Cy33'-ThiolModifierC3Q9.如何溶解引物?干燥后的引物質(zhì)地超級疏松，開蓋前最好瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末搜集到管底。按照計算出的體積加入去離子無菌水或TE緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液搜集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)固。Q10.如何保留弓I物？引物合成后，通過一系列處置和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成無色或白色絮狀干粉。干粉：運輸時常溫運輸，-20t能夠保留一年。貯存液：配好后分裝成幾管，避免反復凍融，-20t能夠保留半年。工作液：常規(guī)利用，4°C保留，也可-20t保留，但應避免反復凍融。修飾熒光引物：需要避光保留，盡快利用為宜。Q11.引物定量不準是怎么回事兒？咱們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告，出現(xiàn)這種情形的可能性有：（1）定量錯誤、分裝錯誤、引物抽干或收樣進程中意外丟失。這種可能性有，可是很少，因為作為專業(yè)的引物合成公司，咱們的生產(chǎn)人員都是通過嚴格的專業(yè)培訓，這種錯誤是要求謹慎避免乃至杜絕的。一般情形下，引物都有留樣備份，接到用戶投訴后，咱們都會找出留樣從頭定量，一般都沒有問題，如確實存在問題，則可安排從頭預備一份。（2）系統(tǒng)誤差，咱們以為10%左右為允許誤差。利用進程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少量誤差不影響實驗。（3）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作致使引物干粉部份丟失。（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數(shù)的含義，沒有能夠正確利用分光光度計，專門是利用微量測定；用戶沒有將OD讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中OD數(shù)。這種情形比較常見。例如，驗證標2OD引物量是不是準確，簡單的做法是：加入1ml水，完全溶解混勻后，取100ul,加入900ul水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm,此光陰吸收的讀數(shù)為。Q12.最長能夠合成多長的弓|物？咱們合成過lOObase的引物，可是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過8Obase。引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大，依照目前的引物合成效率，大于80base的粗產(chǎn)品，全長引物的百分比不高，后續(xù)處置還有丟失很多，最后的產(chǎn)量很低。Q13?為何修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價錢要高？主要因為是修飾單體穩(wěn)固性較差，偶連時刻長，效率低，最后取得的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化進程損失大。修飾引物利用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價錢也高。Q14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？連接反映需要引物的5'磷酸基團。若是需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物若是還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。Q15.若是測序發(fā)覺引物突變，是不是有補償？該如何處置？若是出現(xiàn)測序發(fā)覺引物位置堿基錯誤的情形，咱們能夠免費重合一次，沒有其他任何補償或補償，不承擔其他連帶責任，這是國際行規(guī)。原因咱們在前面已提到，化學合成效率不可能達到100%。若是碰到這種情形，第一和咱們聯(lián)系，咱們會檢查合成序列是不是和原始定單一致，若是確認引物合成序列沒有輸錯，咱們建議從頭挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。按照咱們經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以夠了；40個以上的專門是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情形下，每一個克隆突變的位點都不一樣，正確的老是有的，就是如何找到它。您也能夠要求咱們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的碰到問題的概率。基因拼接進程中，若是發(fā)覺一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，不然就重合一下引物。按照全基因合成的數(shù)據(jù)，咱們的引物能做到2000個堿基的片段，取三個克隆，其中至少有一個是正確的。Q17?為何引物的OD260/OD280小于？需要指出的是OD/OD的比值不能用來衡量引物的純度。OD/OD的比值太低一般是由于引物260280260280中C/T的含量比較高所致。下表是一個20base同聚體引物的OD/OD的比值，清楚表明OD/OD260280260280的比值與引物的堿基組成緊密相關。A ratiosofCrude20-merOligosofDifferingBaseCompositions260/280&rBaseCompositionA260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-35-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-35-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-35” ttttttttTT#TT#T35-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3Q18.—樣的OD用PAGE檢測，EB染色為何深淺不一?通常能夠用EB染色的方式來判斷雙鏈DNA的量（如質(zhì)粒DNA），因為EB能夠嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有不同，比如Oligo（dT）等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就超級差。所以不要用EB染色的方式來定量，而用紫外分光光度計檢測。Q19?如何檢測引物的純度？實驗室方便的做法是用PAGE方式。利用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95°C,2mins）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一按時刻后（約2-3小時），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。若是條件許可，也能夠用銀染方式染色Q20?已經(jīng)溶解的引物，為何原先利用正常，而過一段時刻再利用就不好了？若是您溶解引物的水pH太低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使歷時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議利用10mMTris緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)固。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR利用材料專門是模板的質(zhì)量與先前利用的不完全一致。Q21.引物是咱們設計的，此刻您擴不出來，咱們要負責嗎？不承擔相關責任。咱們?yōu)橐恍嶒灲?jīng)驗不足的客戶，免費設計引物，提供必然的便利。咱們遵循一般的引物設計原則設計好引物以后都會發(fā)給您確認，而后再安排合成并保證引物質(zhì)量?？墒窃O計的引物是不是能夠知足您的實驗要求，必然擴增出您需要的基因片段，誰也不能100%保證。擴增無目的片段是引物質(zhì)量有問題嗎？PCR擴增無目的條帶或非特異性擴增，影響因素是多方面的，需要耐心地分析，如模板結(jié)構(gòu)與質(zhì)量、反映條件、引物設計等等?，F(xiàn)今進展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中碰到的擴不出，擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增拷貝數(shù)很低的基因片段。通過提高模板質(zhì)量、優(yōu)化反映條件等方面找到對策，或有必要時從頭設計引物，最好在實驗時設置對照來判定原因。若是您懷疑引物的問題，請您第一測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是不是正確。若是量是正常的，請您告知我司您的引物編號，咱們會復查留存樣品。如不明原因，咱們免費為您從頭合成一次。若是仍然不能擴增，請您查找其它原因。多數(shù)情形下咱們復檢引物質(zhì)量都沒有問題，因為咱們在引物出售前已經(jīng)嚴格把好質(zhì)量關。Q23?常常利用熒光染料參數(shù)染料Excitation（激發(fā)波長，nm）Emission（發(fā)射波長，nm）顏色6-FAM494518Fluorescein495520Yellow-greenTET521536JOE520548YellowHEX533559CY3550570TAMRA544576Yellow-orangeROX576