表沒食子兒茶素沒食子酸酯與豬胰脂肪酶相互作用的熒光光譜研究

表沒食子兒茶素沒食子酸酯與豬胰脂肪酶相互作用的熒光光譜研究

近年來，肥胖已成為一種常見的健康問題，與人類脂肪酶的活性密切相關。在食物的消化吸收過程中,人體所攝入的大部分脂肪在脂肪酶的作用下被降解,然后在小腸被吸收利用。因此,能有效控制脂肪酶的活性,便可減少食物中脂肪的消化吸收,從而控制肥胖。人們通過飲茶攝入一定量兒茶素類物質(zhì)能在消化道中與胰脂肪酶(PPL)發(fā)生作用,通過抑制酶的活性來減少脂肪吸收。通過飲茶預防肥胖在民間已有廣泛的認識,但目前缺乏基于食品化學的基礎研究。因此,本實驗以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為分子探針,采用熒光光譜及分子對接法研究EGCG與PPL的相互作用,為該類天然產(chǎn)物在減肥食品中的應用及其他相關研究提供一定的參考。1材料和方法1.1材料和試劑EGCG四川碧馥生物科技有限公司;豬胰脂肪酶德國Ruibio公司;橄欖油國藥集團化學試劑有限公司;苯、吡啶、醋酸銅等均為分析純。1.2u3000儀器F-4000熒光光譜儀日本日立公司;2501PC紫外分光光度儀日本島津公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器河南省予華儀器有限公司;GL-20G-C高速離心機上海安亭科學儀器廠;DiscoveryStudio3.1程序美國Accelrys公司。1.3方法1.3.1金屬離子的影響PPL、EGCG和金屬離子溶液均用0.05mol/L的TrisHCl緩沖液(pH7.7)配制。取3mL質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的PPL溶液與0.3mLEGCG溶液于1cm熒光比色皿中混勻(EGCG最終濃度為0×10-5、0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、8.0×10-5、9.6×10-5mol/L),在不同溫度(20、30、37℃)條件下靜置5min后測試。熒光激發(fā)波長280nm,入射和出射狹縫5nm,熒光發(fā)射掃描范圍290~450nm。在研究金屬離子對EGCG-PPL相互作用及熒光特性的影響時,實驗條件同上。于EGCG-PPL混合溶液中分別加入0.3mL濃度為4×10-4mol/L的CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl2溶液,搖勻,37℃溫度條件下靜置5min后分析。1.3.2活性物質(zhì)檢測采用改進的分光光度法測定EGCG對PPL的半抑制濃度(IC50)。PPL、EGCG和金屬離子溶液配制方法同上。取4mLTris-HCl緩沖液和2mL橄欖油于50mL錐形瓶中,37℃水浴5min后,依次加入1mL4×10-4mol/L金屬離子溶液、1mL質(zhì)量濃度分別為0、0.5、0.8、1、1.5、2mg/mLEGCG溶液、1mL2mg/mL酶液。37℃溫度條件下恒溫磁力攪拌5min后加入10mL苯,攪拌混勻后離心,取上層有機相8mL于小錐形瓶中,加入2mL顯色劑(5%醋酸銅,吡啶調(diào)節(jié)至pH6.1),攪拌混勻后離心,于710nm波長處測定上層液吸光度。以空白溶液為參比,計算EGCG對PPL的抑制率,并基于EGCG質(zhì)量濃度與抑制率的回歸方程計算IC50,分析不同金屬離子對IC50的影響。1.3.3受體豬胰脂肪酶-氧化酶-三乙二醇甲醚三聯(lián)體晶體結構采用DiscoveryStudio3.1程序進行分子對接。配體EGCG晶體結構由Zinc數(shù)據(jù)庫(/)提供,能量優(yōu)化后使用。受體豬胰脂肪酶-輔酶-三乙二醇甲醚三聯(lián)體晶體結構(蛋白質(zhì)編碼:1ETH,分辨率2.8?)。通過“FindSitesfromReceptorCavities”模塊尋找EGCG-PPL結合位點,以最佳位點作為活性位點,設定活性球半徑10?,通過CDOCKER進行分子對接。2結果與分析2.1ecgg與ppl相互作用的熒光分析2.1.1蛋白質(zhì)結構變化分析微環(huán)境蛋白質(zhì)的熒光性主要源于分子中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的苯環(huán)和共軛雙鍵結構,其熒光特性與基團的空間結構及環(huán)境密切相關,因此,其可被作為熒光探針分析蛋白質(zhì)結構的變化及微環(huán)境信息。EGCG在實驗條件下無熒光。由圖1可知,EGCG與PPL之間存在明顯的相互作用,隨EGCG質(zhì)量濃度增大,PPL的熒光強度逐漸減小,最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)紅移,這可能是由于EGCG與PPL作用,酶肽鏈伸展,使得部分熒光性氨基酸殘基的空間結構發(fā)生改變。2.1.2ecgg對ppl的熒光創(chuàng)造熒光猝滅通常分為動態(tài)和靜態(tài)過程。動態(tài)猝滅中猝滅劑通過碰撞熒光物質(zhì)使其返回基態(tài),不再發(fā)射光子,而靜態(tài)過程中猝滅劑與熒光物質(zhì)結合,生成不發(fā)射光子的基態(tài)復合物。動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程:式中:F0和F分別為加入猝滅劑前后熒光分子的熒光強度;Kq為猝滅常數(shù)(該值越大猝滅效應越明顯);τ0為熒光分子的初始平均壽命(生物大分子約為10-8s);c為EGCG濃度/(mol/L)。以F0/F對c作圖(圖2),可知不同溫度條件下EGCG對PPL的熒光影響。c小于3.2×10-5mol/L時,F0/F與c具有良好的線性關系。如基于直線斜率及Stern-Volmer方程可知20、30、37℃條件下EGCG對PPL的猝滅常數(shù)Kq分別為2.749×1012、2.346×1012、1.833×1012L/(mol·s)。文獻[12-14]表明各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅常數(shù)為2×1010L/(mol·s),而本實驗所得Kq遠高于由碰撞引起的猝滅效應,這表明在低濃度時,EGCG對PPL的熒光猝滅不是由碰撞造成的,而是由于靜態(tài)猝滅,即EGCG與PPL結合生成了不發(fā)射光子的基態(tài)復合物。隨著EGCG濃度增大,F0/F-c曲線向上彎曲,這表明猝滅劑同時產(chǎn)生了靜態(tài)和動態(tài)猝滅效應。這可能是在靜態(tài)猝滅的同時,高質(zhì)量濃度的EGCG亦可與PPL發(fā)生非結合碰撞,從而引起部分動態(tài)猝滅效應。2.1.3ppl與egg的相互作用靜態(tài)猝滅中猝滅劑與熒光物質(zhì)的結合常數(shù)(Ka)與結合位點數(shù)(n)符合方程:式中:F0、F和c意義與方程(1)相同。如前所述,EGCG能與PPL作用生成不發(fā)射光子的基態(tài)復合物,從而引起PPL靜態(tài)猝滅。以lg[(F0-F)/F]對lgc作圖,由擬合直線的斜率和截距即可求得結合位點及結合常數(shù),其結果列于表1。由此可知,EGCG與PPL的結合常數(shù)達104數(shù)量級,并形成一個結合位點,在20℃溫度條件下二者即能形成較強作用,溫度升高能增強EGCG與PPL作用,但對其結合常數(shù)和作用位點影響不大。2.1.4溫升結合常數(shù)抑制劑與酶之間的作用包括氫鍵、疏水作用、范德華力和靜電作用等,根據(jù)其熵變(ΔS)和焓變(ΔH)可以推斷二者的主要作用方式。根據(jù)公式(3)~(5)可計算EGCG與PPL相互作用的熱力學參數(shù),結果見表2。式中:ΔG、ΔH和ΔS分別為吉布斯自由能、焓變和熵變;R是氣體常數(shù);(Ka)1和(Ka)2分別是溫度T1和T2條件下的結合常數(shù)。計算發(fā)現(xiàn)在不同溫度條件下反應的ΔH值相近,研究中取其均值作為后續(xù)計算的依據(jù)。如表2所示,ΔH>0,說明EGCG與PPL的結合反應是吸熱過程,升溫有利于反應進行,結合常數(shù)Ka將變大,這與表1結果一致。ΔG<0,說明EGCG與PPL的結合反應是一個自發(fā)的過程。焓變ΔH>0,熵變ΔS>0,可以推知EGCG與PPL的結合應主要源于疏水作用。由于ΔH<TΔS,可以認為焓效應對ΔG的貢獻相對較小,因此EGCG與PPL的相互作用主要是熵增所驅動的。大分子弱相互作用中,多種因素會影響其熒光特性。文獻[12-14]表明升溫將降低靜態(tài)熒光猝滅效應,這與觀測結果一致(圖2)。基于上述計算可知,升溫增加了EGCG與PPL的結合常數(shù),可促進二者生成不發(fā)射光子的基態(tài)復合物,但同時高溫也會加劇該基態(tài)復合物的自由運動和相互碰撞,降低其穩(wěn)定性,從而減弱熒光猝滅效應,因此實驗中觀測到EGCG對PPL的熒光猝滅應源于多因素作用結果。2.2fe2+離子對ecgg與ppl的結合特性及對酶活的影響研究發(fā)現(xiàn),EGCG與PPL結合后,酶活受到一定的抑制作用,在37℃溫度條件下EGCG的半抑制質(zhì)量濃度為0.25g/L。實驗中基于熒光和酶活分析,進一步研究了在Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+離子存在條件下EGCG與PPL的結合特性及對酶活的影響。從表3可知,幾種離子對EGCG與PPL的結合產(chǎn)生了不同影響,Ca2+、Mg2+減小了二者的結合強度,而Cu2+、Fe2+對其結合具有促進作用,但4種金屬離子均增大了EGCG對PPL的半抑制質(zhì)量濃度,表明它們能減弱EGCG對PPL活性的抑制。金屬離子對酶活的影響是酶化學研究中的一個重要領域,它們可以通過改變酶的微環(huán)境及改變抑制劑與酶的結合等多種方式來影響酶的催化特性。因此,Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+能減弱EGCG對PPL的酶活抑制,這應源于多種影響的綜合作用,其具體機理還有待進一步研究。2.3ecgg與ppl的相互作用PPL多肽鏈折疊后在N末端活性部位有一疏水通道,從催化中心貫通到分子表面,可結合長鏈脂肪酸,并催化其降解。EGCG分子中含有多個苯環(huán)結構,具有一定的疏水性?；跓晒夥治鼋Y果,EGCG與PPL僅有一個作用位點,所以EGCG可能結合于PPL肽鏈折疊后形成的疏水通道中。實際上,從圖3分子對接得到的最佳構象可以看出,EGCG結合于PPL分子中由PHE78、ILE79、TRP86、LEU154、ALA179、PRO181、PHE216、TRP253、VAL260、ALA261、LEU265等氨基酸形成的疏水腔內(nèi),說明EGCG與PPL的主要結合力為疏水作用,這與熱力學計算結果一致。圖3b表明,EGCG可與結合位點周圍的氨基酸ASP80、TYR115、HIS152、SER153、ARG257形成氫鍵,此外,EGCG分子的苯環(huán)還能通過Pi-Pi堆疊與PPL分子中的含芳香環(huán)氨基酸(如TYR115)發(fā)生作用。上述結果表明,EGCG與PPL之間除了疏水作用外,氫鍵與Pi-Pi堆疊也能促進二者的相互作用。EGCG與PPL的相互作用可使PPL肽鏈伸展,并引起PPL熒光猝滅。分子對接研究表明,在二者作用中,EGCG與肽鏈中多個熒光性氨基酸相距很近(如TRP86、TYR115、TYR268),可導致這些基團暴露在疏水環(huán)境中,從而引起PPL熒光發(fā)射峰紅移。不同脂肪酶的活性中心通常是由絲氨酸(Ser)和組氨酸(His)組成,并與另一氨基酸殘基(天冬氨酸或谷氨酸)一起組成一個三元催化中心。EGCG與PPL活性中心基團SER153、ASP177、HIS264相距較近,并能與SER153形成