詳細介紹抗體的分離純化精編版

2016.12.051抗體的制備、純化及其應(yīng)用

12/12/20162抗體的分離和純化12/12/2016抗體的分離純化3無論是將抗體用于研究還是用于檢測或臨床治療，均需對抗體進行分離與純化。分離：將抗體從其存在的體液或培養(yǎng)液中分離出來并加以初步純化。純化：提高分離出來的抗體的純度，并將其中的雜質(zhì)控制在所需的低水平。對治療性抗體尤為重要。

12/9/20164一、樣品處理分子類型產(chǎn)量特定的污染物來源：野生型人類血清多克隆的IgG，IgM，IgA，IgD，IgEIgG8-16mg/ml，IgM0.5-2mg/ml；IgA1-4mg/ml；IgD10-400mg/ml；IgE0.4mg/ml白蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，a大球蛋白和其它血清蛋白雜交瘤細胞懸浮培養(yǎng)物單克隆多達1mg苯酚紅，白蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，牛IgG，a大球蛋白和其它血清蛋白，或者病毒無血清的雜交瘤細胞懸浮培養(yǎng)物單克隆1-4mg/ml白蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，常常取決于培養(yǎng)基的情況腹水單克隆1-15mg/ml酯類，白蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，脂蛋白，內(nèi)源的IgG和其它的宿主蛋白蛋清IgY3-4mg/ml酯類，脂蛋白來源：重組表達胞外蛋白，表達到上清里面掛有表達標(biāo)簽的的抗體，抗體融合蛋白，F(xiàn)ab，或者其片段取決于表達系統(tǒng)宿主來源的蛋白，如大腸桿菌中的蛋白等，通常污染物較少胞內(nèi)表達取決于表達系統(tǒng)來自宿主的蛋白，如大腸桿菌或者噬菌體等天然和重組型抗體主要污染物來源的總結(jié)

12/9/20165在樣品純化前要做的主要工作有：?除去某些雜質(zhì)，如脂蛋白或者苯酚紅等。?除去大量的雜志，如粗品中的含量大的雜蛋白等。?更換緩沖液并除鹽，把樣品換到合適的緩沖液中（PH和鹽濃度），并除去沒有用處的小分子。

12/9/20166純化前除去特定的雜質(zhì)脂蛋白脂蛋白和其它含脂物質(zhì)能夠阻塞色譜層析柱，最好能在純化前除去，腹水通常含有高濃度的脂蛋白。方法一：在二價離子存在的情況下，硫酸右旋葡糖酐能夠沉淀脂蛋白，沉淀可以通過離心除去。步驟如下：1．每毫升樣品中加入0.04ml10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml1M的CaCl2；2．混合15分鐘；3．10,000g離心10分鐘；4．丟棄沉淀；5．使用脫鹽柱將樣品換到適合純化的緩沖液中；注意：離心通常能夠避免過濾時造成的蛋白非特異性吸附，血清蛋白樣品可以通過玻璃絨毛過濾以除去酯類。

12/9/20167步驟如下:1.加入固體PVP到樣品溶液中,至最終濃度為3%(w/v);2.在4度攪拌4小時;

3.17,000g離心;

4.丟棄沉淀;5.使用脫鹽柱將樣品換到適合純化的緩沖液中;方法二:PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能產(chǎn)生一個pH值依賴的沉淀效應(yīng),PVP在pH=7.0時能夠沉淀b-脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能夠在低于pH4.0時沉淀。

12/9/20168苯酚紅是一種在實驗室細胞培養(yǎng)中的pH指示劑,雖然并不直接的影響純化,但是苯酚紅可能結(jié)合到某些純化介質(zhì)上,應(yīng)該盡可能早的被除去。苯酚紅能夠在pH>7時結(jié)合在陽離子柱上。苯酚紅注意：使用脫鹽柱除去苯酚紅,并且把樣品轉(zhuǎn)移到合適的緩沖液中以做進一步純化。

12/9/20169血清、腹水、細胞懸浮物或者細胞裂解物的凈化離心或者過慮是實驗室凈化樣品最常用到的手段，這些方法適用于任何來源的少量樣品。注意：離心或者過慮后馬上進行色譜層析純化。離心用于除去大多數(shù)顆粒物質(zhì)，如細胞碎片。如果在離心后樣品仍然混濁，可以再選用一次5um的濾膜過濾，再用濾膜再次過濾。注意：對于少量的樣品或者蛋白能吸附在濾膜上，可以用10000×g離心15分鐘。對于細胞樣品，可以在40000到50000×g離心15分鐘，若樣品需要短處理時間，可以減少到10到15分鐘。離心時使用冷凍功能，并且在冷室或者離心機中提前預(yù)冷轉(zhuǎn)子。血清樣品可以在離心之后用玻璃絨毛過濾以除去剩余的酯類。一、離心和過濾

12/9/201610過濾能除去顆粒物質(zhì)。醋酸纖維素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能夠有效的減少對蛋白的非特異性吸附。在色譜層析前，依照色譜層析的膠粒大小選擇合適的濾膜孔徑，這些列在下表中。濾膜通常的孔徑大小色譜層析柱中柱材的顆粒大小1um90um或者更大0.45um30或者40um0.22um3，10，15um，或者需要更加干凈的樣品時采用選擇濾孔大小注意：用一個預(yù)跑來檢測目標(biāo)蛋白的收率，因為有時候樣品可能被濾膜表面非特異性吸附。過濾器可能會飽和——就是濾膜有一個特定的載量，因此在建立一個純化步驟時，需要考慮這些。影響離心法的因素離心機的種類、離心方法、離心介質(zhì)以及密度梯度（一）離心速度低速離心一般用離心速度，即轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如5000r/min等。高速離心和超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示，如60000×g等。相對離心力是指顆粒所受到的離心力與地心引力之比值。即：

12/9/20167（二）離心時間依據(jù)離心方法的不同，離心時間的概念也有差別。常速離心、高速離心和差速離心的離心時間，是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到管底的時間，即沉降時間；密度梯度離心的離心時間，是指形成界限分明的區(qū)帶時間，即區(qū)帶形成時間；等密度梯度離心所需的離心時間，是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間，即平衡時間。8離心時間過長或過短，都會影響顆粒在離心管內(nèi)的預(yù)期位置，降低分離效果。

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12/9/2016（三）溫度為防止欲分離物質(zhì)在離心過程中的聚集、變形和失活，離心溫度一般控制在4℃左右。離心速度較低或者物質(zhì)的耐熱性較好，也可以在室溫條件下進行。超速離心和高速離心，轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會發(fā)熱而引起溫度升高，必須采用冷凍系統(tǒng)。13（四）pH離心介質(zhì)的pH必須是處于待分離物質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，必要時可用緩沖溶液。pH過高或過低都可能引起生物活性物質(zhì)的變性、失活，還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機其它部件的腐蝕，應(yīng)加以注意。

12/9/2016第二節(jié)沉淀分離14

如果樣品中含有大量的低分子污染物,使用脫鹽柱作為第一步色譜層析制備樣品。增加鹽濃度能夠增強蛋白間的疏水相互作用,疏水性的不同導(dǎo)致了一個選擇性沉淀。使用沉淀法去除大量的雜質(zhì)低分子污染物一、鹽析法在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析”。優(yōu)點：①成本低，不需要昂貴的設(shè)備；②操作簡便，安全；③對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；④對pH、溫度要求不嚴格。缺點：分離效果有限

12/9/201615沉淀劑使用的典型條件樣品類型備注硫酸銨下文有叔大于1mg/ml蛋白,特別使免疫球蛋白用于穩(wěn)定的蛋白,不會變性,上清可以直接上到HIC（疏水層析柱）,減少了脂蛋白含量右旋硫糖苷加入0.04mlof10%右旋硫糖苷和1mlof1MCaCl2/ml混勻15min并10000×g離心可用于高脂蛋白的樣品,例如腹水沉淀脂蛋白乙烯聚合物加入3%(w/v)后攪拌4小時,并17000×g離心可用于高脂蛋白的樣品,例如腹水可以選擇右旋硫糖苷PEG(Mr>4000)最多到20%血漿蛋白沒有變性,上清可以直接過離子交換或親和柱,完全除去比較困難丙酮(冷的)在0攝氏度最多到80%,在最高轉(zhuǎn)速離心后收集小球可能會不可逆的使蛋白變性,適合于小肽的制備或者制備電泳樣品聚乙烯亞胺0.1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫化精蛋白1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫酸鏈霉素1%(w/v)沉淀核酸辛酸1:15(w/w)抗體含量應(yīng)該大于1mg/ml沉淀血清或者腹水中的大量蛋白,僅把免疫球蛋白留在溶液中常用的沉淀劑

12/12/2016蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是減弱甚至消除蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜。同時，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導(dǎo)致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。16

（一）鹽析的基本原理

12/12/2016常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等硫酸銨最為常用，其優(yōu)點是：溶解度大；溫度系數(shù)?。幻芏刃?，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2mol/L~3mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價廉易得；分離效果比其它鹽好。但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。17

（二）鹽類和濃度的選擇硫酸銨沉淀通常作為蛋白濃縮純化的第一步。這個方法通?？梢杂行У某ゴ罅堪椎鞍?、鐵傳遞蛋白和其它大量可溶雜質(zhì)。18飽和硫酸銨溶液:100ml蒸餾水中加入100g硫酸銨,攪拌溶解;1MTrisHclpH8.0;

作為第一步純化的緩沖液所需溶液:1.過濾(0.45um),或者10,000g4度離心;2.在10份樣品中加入1份TrisHcl

pH8.0,以保持pH值;3.溫和攪拌,逐滴加入硫酸銨溶液到50%飽和度,攪拌一小時;4.10,000g離心20分鐘5.去除上清,用等體積的硫酸銨重懸洗滌沉淀兩次(例如,不能夠重懸蛋白或者進一步沉淀蛋白的溶液),再次離心;6.用少量下步中所用緩沖液重懸沉淀;

7.硫酸銨可以在superdex

G25中得到除去;*通過調(diào)整硫酸銨濃度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀雜質(zhì)。??離心后丟棄脂蛋白,樣品可以通過玻璃絨毛以出去脂類。一些抗體可能被直接使用固體硫酸銨所破壞,硫酸銨沉淀應(yīng)該盡可能的使用液體,在重懸時盡可能避免氣泡的產(chǎn)生。??在硫酸銨沉淀后,使用HIC作為后續(xù)步驟是最方便的。通常,可重復(fù)的純化過程,應(yīng)該避免使用硫酸銨沉淀,而選擇用proteinG或proteinA

Sepharose柱子。通常,鹽沉淀應(yīng)該在蛋白濃度低于1mg/ml時進行。加入等體積的飽和溶液(甚至35%-40%),能夠減少鐵轉(zhuǎn)移蛋白和白蛋白的污染。硫酸銨沉淀

12/12/2016（三）影響鹽析的因素1.蛋白質(zhì)的濃度過高過低都不好，一般認為2.5%~3.0%蛋白質(zhì)濃度比較合適。2.pH蛋白質(zhì)所帶的凈電荷越多，溶解度越大。鹽析時溶液pH常選擇接近蛋白質(zhì)等電點，使蛋白質(zhì)的凈電荷接近零。3.溫度鹽析一般對溫度要求并不嚴格，可在室溫下進行。但對溫度敏感的物質(zhì)，要求在0℃~4℃進行，防止蛋白質(zhì)變性。4.離子強度離子強度越高，蛋白質(zhì)溶解度越低，鹽析也越易發(fā)生。不同蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析所需要的離子強度不同19

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蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有：透析法超濾法葡聚糖凝膠G50層析法。20

（四）脫鹽

12/12/2016第三節(jié)離子交換層析法離子交換層析法（ionexchangechromatography，IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時結(jié)合力的差別，而進行分離的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。21優(yōu)點：①重現(xiàn)性好，簡單易行；②分辨力強，回收率高；③具有多孔性，表面積大、交換容量大；④具有親水性，對大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。

12/12/201622離子交換法的固定相是離子交換劑；若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽離子則直接流出，不會被吸附上去。這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為counterion（抗衡離子），因為其電荷與擔(dān)體上的電荷相反(counter是"相反"的意思)

離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團，根據(jù)這些基團所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。一、 基本原理

12/12/2016陽離子交換反應(yīng)：R-A-H++Y+—R-A-

Y+

+H+

陰離子交換反應(yīng)：R-B+OH-+X-—R-B+X-+OH-

R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，A-

和B+分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結(jié)合的電荷基團，H+

和OH-分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，Y+

和X-分別代表溶液中的離子基團。23

12/12/201624離子交換層析對物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管（1.5cm×15cm）中進行的。含有預(yù)被分離的離子的溶液通過離子交換柱時，各種離子即與離子交換劑上的荷電部位競爭結(jié)合。任何離子通過柱時的移動速率取決于與離子交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競爭性離子的性質(zhì)和濃度。

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12/12/2016兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應(yīng)盡量避免。

洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。26

12/12/2016三、技術(shù)要點（一）離子交換劑的選擇和處理兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6～8）下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活，應(yīng)盡量避免。處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。（二）裝柱和加樣選擇平衡緩沖液的離子強度和pH時，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達到分離的目的。溶液的離子強度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強度液，常用的離子強度為20mmol/L~50mmol/LNaCl。27

12/12/201628（三）洗脫和收集洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強度，也可同時改變pH與離子強度的方法。改變pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強度的梯度洗脫。用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。（四）離子交換劑的再生與保存使其帶上所需的平衡離子。

12/12/2016四、影響交換容量的因素①離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及分離的樣品組分的質(zhì)量大?。阂话汶x子交換劑的孔隙應(yīng)盡量讓樣品組分進入，使樣品組分與離子交換劑作用面積增大。充分暴露電荷基團增加有效交換容量；②離子強度：溶液中離子強度增大時，離子對交換劑上的束縛位點就會增強競爭作用，降低有效交換容量；③pH：弱酸型離子交換劑隨著pH的增大，電荷基團解離增加，交換容量加大。但弱堿型離子交換劑的交換容量隨著pH的下降而增大。帶有強電荷基團的離子交換劑在任何pH的溶液中都處于解離狀態(tài)，所以交換容量基本與pH變化無關(guān)。29

12/12/2016第四節(jié)凝膠層析（gelchromatography）

凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）

分子篩層析（molecularsievechromatography）是以各種多孔凝膠為固定相，當(dāng)混合物隨流動相經(jīng)過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。該法設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高，不需要有機溶劑、不改變樣品生物學(xué)活性，除常用于分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等物質(zhì)外，還可以用于測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。30

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12/12/201632凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。一、基本原理

12/12/201633（1）蛋白質(zhì)混合物上柱;（2）洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻于顆粒之外;（3）小分子被滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開;（4）大小分子完全分開;（5）大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。

12/12/201634如果兩種以上不同相對分子質(zhì)量的分子都能進入凝膠顆粒網(wǎng)孔，但由于它們被排阻和擴散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時間也不同，從而彼此也可以分離開來。凝膠層析中物質(zhì)的分子量不是唯一的分離依據(jù)，有些物質(zhì)的分子量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質(zhì)與凝膠之間存在著非特異性的吸附作用，故仍然可分開。

12/12/2016二、常用凝膠凝膠是一類不溶于水，在水中有較大膨脹度和較好分子篩功能的化合物。常用的有：葡聚糖凝膠（dextran）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等。35

12/12/2016第五節(jié)親和層析法親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。配體本身必須有兩個基團：一個能與載體共價結(jié)合，連接后的配體對互補分子的親和力不會改變一個能與被親和分子結(jié)合。36

12/12/201637親和層析法有點像在釣魚，魚是我們所要的分子(B)雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚餌是與B具有專一性的分子(A,上圖1)；A與B的專一性很高，只會在樣本中與B結(jié)合，而排除其它雜質(zhì)(上圖2)；若把結(jié)合在吸著劑上的B溶離下來，就可以得到均質(zhì)的B(上圖3)。

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12/12/2016二、載體和配體的選擇（一）載體理想的載體應(yīng)具備以下特性：1.高度的親水性，使固相配體易與水溶液中的生物大分子物質(zhì)接近。2.惰性載體，非特異吸附性極低。3.具有相當(dāng)量的化學(xué)基團可供活化，而且容易和配體結(jié)合，不改變載體和配體的基本性質(zhì)。4.具有較好的理化穩(wěn)定性，不易受到周圍條件（如pH、離子強度、溫度、變性劑和去污劑等）的影響。機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速。5.具有均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和的大分子自由通過而增加配體的有效濃度。常用的載體有纖維素、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和多孔玻璃等。39

12/12/2016（二）配體優(yōu)良的配體須具備以下特性：1.配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力。2.配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強的特異性，不與其它組分有非特異性吸附作用。3.配體必須具備與載體共價結(jié)合的功能基團，而且這種結(jié)合不能嚴重影響配體間的親合力及結(jié)合特異性。4.配體應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性，能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。40

12/12/201641親和層析中部分蛋白配體配基純化的物質(zhì)蛋白A/蛋白G各種免疫球蛋白單克隆抗體各種抗原、蛋白A抗原特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶血凝素糖蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白糖血凝素、糖苷甘酶生物素親和素、生物素結(jié)合蛋白肝素凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、連接組織蛋白酶鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶Triazine染料脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等

12/12/2016一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽：6組氨酸標(biāo)簽組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合在低pH下用咪唑競爭洗脫42

12/12/201643抗體純化填料選擇要點一、填料種類的選擇1）血清中的抗體含量

備注：ProteinA/G通常結(jié)合抗體的重鏈，而proteinL通常結(jié)合抗體的輕鏈。重鏈和輕鏈都有亞型之分，不同亞型對proteinA/G/L的結(jié)合能力不同。其中proteinL結(jié)合kappa鏈，不同物種血清總抗體中kappa鏈的比例不同。

12/12/2016442）proteinA/G/L的結(jié)合特異性BindingAffinitiesofrecombinantProteinL,ProteinA,andProteinGImmunoglobulinbindingdomains備注：上面這張表來自于pierce的說明書，給出了重要信息，對于不同抗體，ProteinA/G/L的結(jié)合能力不同。通常我們推薦首選proteinA填料，這種填料使用最廣泛，有耐堿性的填料可以選擇。只有當(dāng)proteinA填料結(jié)合不好，才選擇proteinG填料。

L不到最后要考慮。因為proteinL雖然在上表中看起來可以結(jié)合很多種類的抗體，其實它只結(jié)合kappa鏈，而kappa鏈本身還有進一步的亞型之分，所以對于單抗來說，不結(jié)合proteinL填料的概率是比較大的。

12/12/201645二、結(jié)合條件的優(yōu)化1）proteinA的結(jié)合條件備注：親和填料選定以后，需要考慮結(jié)合條件，洗脫條件的優(yōu)化。只有經(jīng)過優(yōu)化，才能獲得最高的純度的同時保持抗體的活力,特別需要優(yōu)化的是pH。相對而言proteinA對抗體的結(jié)合需要稍高一點的pH,具體選擇見上表。

12/12/201646由proteinA/G對鼠抗igG1的親和力表