無菌檢查微生物限度檢查方法學驗證實例

無菌檢查、微生物

限度檢查方法學

驗證實例11/10/20231虎杖苷注射液無菌檢查的方法驗證

樣品：虎杖苷注射液由深圳海王藥業(yè)有限公司提供，批號20040305。培養(yǎng)基：無菌檢查用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，批號040203；霉菌液體培養(yǎng)基，批號040302；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號0403045；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號040513；0.1%蛋白胨溶液，批號050217；虎紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號040202；由中檢所所培養(yǎng)基室提供。11/10/20232方法：中國藥典2005版無菌檢查中薄膜過濾法方法驗證

驗證試驗用菌種：驗證試驗用菌種包括金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢桿菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），來自中國醫(yī)學細菌保藏中心。11/10/20233菌液制備：取經34℃培養(yǎng)18～24小時的金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5～10－7約為50～100cfu/ml備用。取經24℃培養(yǎng)18～24小時的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5約為50～100cfu/ml備用。11/10/20234

取經34℃培養(yǎng)18～24小時的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－7備用。取經培養(yǎng)一周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加0.9%氯化鈉溶液3ml，洗下孢子，轉移至另一空管，標準比濁管比濁后，取1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10－4約為50～100cfu/ml備用。

11/10/20235供試液制備：取樣品10瓶分別加0.1%蛋白胨溶液30ml溶解后，過濾。7.活菌計數活菌計數結果見表1。11/10/2023611/10/20237

方法驗證直接接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養(yǎng)基2ml/支后，再按要求加入相應的陽性菌液（30-100個/ml），置規(guī)定溫度培養(yǎng)3-5天，逐日觀察結果。11/10/20238薄膜過濾法：取樣品11支，將樣品過濾于封閉式濾器（3聯筒/套），用0.1%蛋白胨氯化鈉溶液沖洗500ml后，再分別人工污染金黃色葡萄球菌、枯草桿菌50~100個/筒即可，同時平行做稀釋劑的對照組。將稀釋劑對照濾筒和污染陽性菌的驗證濾筒置37℃-培養(yǎng)3～5d，逐日觀察，結果見表2、3、4。

11/10/2023911/10/20231011/10/20231111/10/202312結論：根據上述結果，由于采用直接接種法進行虎杖苷注射液的無菌檢查，存在對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌生長的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的無菌檢查應依據中國藥典無菌檢查方法中的薄膜過濾法進行，沖洗量規(guī)定為500ml。

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頭孢噻肟鈉無菌原料的無菌實驗方法驗證

樣品：頭孢噻肟鈉無菌原料，規(guī)格：0.5g/瓶；批號：；生產單位：AventisPharmaDeutschlandGmbH培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂(均由中國藥品生物制品檢定所培養(yǎng)基室提供)β-內酰胺酶：2ml大于300單位/毫升（批號：）11/10/202314驗證試驗用菌種：（1）金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；(2)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；(3)大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]；(4)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；（5)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]；(6)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；

(7)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。

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儀器和濾器：HTY-2000A集菌儀，全封閉無菌試驗過濾培養(yǎng)器（批號）北京牛?；蛴邢薰?。

方法：中國藥典2005年版無菌檢查的驗證實驗

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操作方法菌液制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,32.5±2.5℃培養(yǎng)18～24小時；11/10/202317

取經32.5±2.5℃培養(yǎng)19~21h小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約10-5~10-8之間。取經36℃培養(yǎng)18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，混勻備用。11/10/202318

白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中[見附錄1.3],25.5±2.5℃培養(yǎng)24～48小時。取經25.5±2.5℃培養(yǎng)72小時的白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉移至空試管作為原液，取1ml加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取1.2ml加生理鹽水9ml，混勻備用。

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將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.5±2.5℃培養(yǎng)5～7d，使大量的孢子成熟。取經25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉移至空試管作為原液，稀釋至10-4，取0.5ml加生理鹽水10ml混勻備用。11/10/202320菌液計數：分別取上述5種細菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入營養(yǎng)瓊脂約18ml。30~35℃培養(yǎng)（生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）。分別取上述2種真菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入虎紅瓊脂約18ml。23~28℃培養(yǎng)。

11/10/202321供試液制備：每2支以100ml生理鹽水溶解，混勻備用。薄膜過濾：將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次50ml，在最后一次的沖洗液中逐一加入試驗菌少于100CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內。每天觀察并記錄結果。11/10/202322陽性對照：另取濾筒，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗菌及相應的培養(yǎng)基逐一進行驗證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及真菌培養(yǎng)基2桶，100ml/桶。陰性對照：兩個濾器桶內各過濾生理鹽水200ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100ml，不加對照菌液，分別于30-35℃及23-28℃培養(yǎng)。11/10/202323

培養(yǎng)：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基桶30-35℃培養(yǎng)；真菌培養(yǎng)基桶23-28℃培養(yǎng)。觀察結果。結果細菌和真菌數計數結果分別見表1和表2。

11/10/202324表1細菌數計數

表2真菌數計數結果

菌種大腸埃希菌金黃色葡萄球菌

枯草芽孢桿菌

銅綠假單胞菌

生孢梭菌

計數(CFU)22263639626658542020均值(CFU)2438645620菌種黑曲霉菌

白色念珠菌

計數(CFU)86938683均值(CFU)898511/10/202325實驗結果見表3和表4表3細菌實驗結果(20小時觀察)

11/10/202326表436小時觀察真菌結果

11/10/202327

大腸埃希菌菌液制備：取經35℃培養(yǎng)19~20h的大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取0.4ml加鹽水10ml混勻，做活菌計數備用。

取12支樣品，每2支以100ml生理鹽水溶解，沖洗100ml每次，做沖300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml和β-內酰胺酶2支。分別加入大腸桿菌菌液（肉湯培養(yǎng)物10倍稀釋至10-7）1ml。結果見表5。

11/10/202328表5實驗結果（大腸埃希菌菌數54CFU）

培養(yǎng)時間14h25h38h110h沖洗量300ml----沖洗量500ml--++沖洗量800ml-+++陽性對照++++11/10/202329結論：

頭孢噻肟鈉無菌原料無菌檢查法:,取樣量3.0克，采用薄膜過濾法（封閉濾器為北京牛?；蚣夹g有限公司生產）。沖洗液為0.9％的氯化鈉溶液，沖洗量800ml，加酶量2支（大于300單位/ml）以大腸埃希菌為陽性對照菌。

11/10/202330復方磷酸可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法驗證實驗

樣品：復方磷酸可待因（歐博士止咳露），批號309315、402021，生產廠家為香港歐化藥業(yè)有限公司。驗證用菌種：

枯草桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、

黑曲霉CMCC(F)98003。方法：

中國藥典有關微生物限度檢查法方法驗證試驗。

11/10/202331具體操作方法菌液制備：取經37℃培養(yǎng)18~24h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5~10-7，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。(2)取經25℃培養(yǎng)18~24小時的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5~10-7，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。11/10/202332

取經25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，

用標準比濁管比濁，然后取1ml+9ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。

供試液制備：

吸取樣品10ml，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗菌株。

11/10/202333回收率測定：試驗組:分別取不同品種的1：10供試液1ml、50~100個/ml試驗菌株同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72小時觀察結果。薄膜過濾法以最后一次的沖洗液加入試驗菌.(2)活菌組

測定每一菌株的試驗菌數(3)供試液對照

測定供試品本底菌數(4)稀釋劑對照組11/10/202334結果菌落計數結果、常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法在復方磷酸可待因微生物限度檢查法的驗證結果見表1、2和表3。11/10/202335表1菌落計數（cfu/ml）

實驗次數金葡菌10-5枯草桿菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大腸埃希菌10-7194、90130、8073、72110、9014、15280、7445、23128、108110、12054、343153、15078、7773、74110、10030、2711/10/202336表2復方磷酸可待因微生物限度檢查方法驗證

（常規(guī)法）

實驗次數人工染菌回收率%金葡菌枯草桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌10.0271.481.1100.0100.0229.229.4100.0100.0100.03抑菌抑菌100.0100.0100.011/10/202337從表2結果可以看出:（1）采用常規(guī)方法檢驗復方磷酸可待因溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%