固定化胰蛋白酶水解烏肉雞工藝研究

固定化胰蛋白酶水解烏肉雞工藝研究

兔子也被稱為烏骨雞。這是一種雙重藥物和營養(yǎng)的飼料。烏江富含蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、鐵、磷、v1、vb2等。特別是在烏雞皮、骨和肉中含有大量黑色素,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為烏雞的藥用價值和食用價值與體內(nèi)的黑色素物質(zhì)有關(guān),其主要功能是滋補、強身、健體、抗衰防老。同時在烏雞肉中含有17種氨基酸,其中13種高于普通雞。我國已廣泛開發(fā)的烏雞白鳳丸,是傳統(tǒng)藥物中著名的滋補中成藥。傳統(tǒng)的制備烏雞藥物的方法多是將烏雞直接蒸煮,再加工成各種產(chǎn)品,此種工藝不僅使烏雞有效成分利用率低,而且藥物中雜質(zhì)多、色澤深和有效成分低。近年來,采用酶法水解烏雞肉制備出多種藥物及功能食品,可以提高烏雞肉利用率,改善藥物品質(zhì)。本實驗利用固定化酶酶工程技術(shù),水解烏雞肉制備具有抗氧化、促進脂質(zhì)代謝、降低膽固醇、增強機體免疫力等作用的功能肽,探討水解烏雞肉的工藝條件,為烏雞肉的綜合開發(fā)與利用提供技術(shù)參考。1材料和方法1.1上海化學(xué)試劑烏雞由徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場購買。胰蛋白酶(3000U/g)杭州三葉生物化工廠;海藻酸鈉上?；瘜W(xué)試劑站分裝;戊二醛天津福晨化學(xué)試劑廠;無水氯化鈣天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;聚醚砜超濾膜北京安德膜技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2實驗設(shè)備TU-1810PC型紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司;HYG-I轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速柜上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;DZF-6020型真空干燥箱上海精密實驗設(shè)備有限公司;FlowMemD250小試平板超濾膜設(shè)備福建廈門世達膜科技有限公司;DL-5低速大容量離心機上海安亭科學(xué)儀器廠。1.3方法1.3.1固定化酶活性測定烏雞肉→蒸煮(30min)→粉碎打漿→稱重→調(diào)pH7.5→加固定化胰蛋白酶→恒溫振蕩4h→過濾去除固定化酶微?！x心分離(4800r/min)→上清液測氨基氮(AN)1.3.2固定化胰蛋白酶活力將海藻酸鈉和胰蛋白酶分別溶于Tris-HCl緩沖液中,37℃使海藻酸鈉溶化,按一定比例與胰蛋白酶混合,4℃靜置過夜,吸入注射器內(nèi)逐滴滴入2%氯化鈣溶液中,移入4℃冰箱硬化4h,過濾洗滌,加入3%的戊二醛溶液交聯(lián)6h,水洗,將殘余戊二醛洗去,測定固定化胰蛋白酶活力,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.3固定化胰蛋白酶的活力測定以苯甲酰L-精氨酸乙酯(BAEE)為底物用紫外分光光度法測定,在酶反應(yīng)時保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)使混合均勻。1.3.4游離氨基酸氮含量的測定采用甲醛法測定烏雞肉酶解液中氨基氮(AN)的含量。1.3.5功能肽超濾工藝流程按蔣菁莉等的方法按說明安裝超濾裝置,取3kD的聚醚砜超濾膜及連接管,先用0.3%NaOH溶液處理,然后對經(jīng)過處理的功能肽粗品用3kD膜組件以全面回流的方式進行超濾,在0.08MPa壓力以下,收集超濾液。1.3.6固定化因素的篩選根據(jù)相關(guān)文獻資料,以海藻酸鈉濃度、加酶量、pH值和溫度等對胰蛋白酶固定化影響較大的因素為考察因素,選定L9(34)正交表進行試驗,因素水平如表1所示。1.3.7固定化胰蛋白酶法解決烏拉雞的因素選擇根據(jù)單因素試驗結(jié)果,綜合考察主要因子以及不同水平的互相作用對烏雞肉水解的影響,L16(45)正交表進行試驗,因素水平如表2所示。1.3.8固定胰蛋白酶的穩(wěn)定實驗利用固定化胰蛋白酶水解烏雞肉,重復(fù)使用后測定水解液中氨基氮的含量,觀察酶活力保持50%以上的最高使用次數(shù)。1.3.9功能肽洗脫曲線測定經(jīng)過截留分子量為3kD超濾后的烏雞肉蛋白功能肽濾液,通過SephadexG-25凝膠層析柱(1.5cm×80cm),用10%乙醇溶液為洗脫劑,控制流速為20ml/h,以每管3ml收集洗脫液,在280nm波長處測光密度值,得到超濾液的功能肽洗脫曲線。2結(jié)果與分析2.1固定化胰蛋白酶項目的選擇2.1.1海藻酸鈉固定化胰蛋白酶效果海藻酸鈉濃度對固定化酶凝珠的機械強度、質(zhì)量傳遞等有直接影響,利用不同濃度的海藻酸鈉固定化胰蛋白酶效果,結(jié)果見表3。由表3可知,當(dāng)海藻酸鈉濃度為4%時,成球容易,凝珠強度適中,球形狀圓型,酶活力回收率最高為33.12%,故選擇4%的海藻酸鈉。2.1.2固定化效果的確定通過正交試驗優(yōu)化固定化胰蛋白酶的工藝條件,結(jié)果如表4所示。由表4極差分析可知,各個因素對固定化效果的影響順序為A>B>C>D,即海藻酸鈉>加酶量>pH值>溫度。最優(yōu)方案為A2B2C3D2,即海藻酸鈉濃度4%,加酶量10%、pH7.5、溫度70℃,按優(yōu)選工藝A2B2C3D2重復(fù)3次,酶活力回收率為38.84%,表明實驗所確定的最佳工藝為較優(yōu)工藝。2.2固定胰蛋白酶有助于吳肉的處理2.2.1烏雞的固定化酶水解結(jié)果選用pH7.5、固液比1:4、溫度60℃、時間6h,加入不同量的固定化酶水解烏雞肉,結(jié)果見圖1。由圖1可知,隨著酶用量的增加,氨基氮含量增加,當(dāng)加入10%固定化胰蛋白酶時,對烏雞肉的水解效果最好,氨基氮最高為1.87mg/ml,故酶用量選10%。2.2.2不同固液比對烏豬肉選用pH7.5、加酶量10%、溫度60℃、時間6h,不同的固液比水解烏雞肉,結(jié)果見圖2。由圖2可知,隨著固液比的增加,氨基氮含量增加,固液比1:4時,氨基氮含量最高為2.11mg/ml,故固液比選1:4。2.2.3不同ph值對烏豬肉的水解效果選用加酶量10%、溫度60℃、時間6h、固液比1:4,不同的pH值水解烏雞肉,結(jié)果見圖3。由圖3可知,固定化胰蛋白酶水解烏雞最適pH7.5,氨基氮含量最高為1.97mg/ml。2.2.4不同溫度對雞水解過程中活性成分的影響選用pH7.5、固液比1:4、時間6h、酶用量10%,不同溫度水解烏雞,結(jié)果見圖4。由圖4可知,固定化胰蛋白酶水解烏雞肉最適溫度為60℃,氨基氮含量為2.10mg/ml。2.2.5不同時間水解烏雞肉選用pH7.5、加酶量10%、固液比1:4、溫度60℃,不同時間水解烏雞肉,結(jié)果見圖5。由圖5可知,隨著水解時間的延長,水解率逐漸升高,固定化酶水解烏雞肉的最佳時間為6h,氨基氮含量最高為2.10mg/ml。2.3氨基氮含量的影響采用正交優(yōu)化固定化胰蛋白酶的最佳條件組合,水解烏雞肉,結(jié)果見表5。由表5極差分析可知,各個因子對水解烏雞肉氨基氮含量的影響為C>A>B>D,即加酶量影響最大,其次是固液比和pH值,溫度影響最小。最優(yōu)方案為A1B2C1D3,即固液比1:3、pH7.5、加酶量是10%、溫度60℃,按優(yōu)選工藝A1B2C1D3重復(fù)3次實驗,氨基氮含量平均為2.18mg/ml,表明實驗所確定的水解工藝為較優(yōu)工藝。2.4固定化胰蛋白酶水解烏雞采用固定化胰蛋白酶水解烏雞肉,重復(fù)使用后,檢查對烏雞肉水解保持50%酶活力的使用次數(shù),結(jié)果見圖6。由圖6可知,使用固定化胰蛋白酶水解烏雞肉,第1次水解液中的氨基氮含量為2.10mg/ml,當(dāng)使用到第8次后氨基氮的含量仍為1.08mg/ml。固定化胰蛋白酶的活力保持在50%左右,說明固定化胰蛋白酶具有良好的穩(wěn)定性。2.5測定波長的測定采用3kD的超濾液,經(jīng)SephadexG-25凝膠層析柱分離,用10%乙醇溶液洗脫,在280nm波長處測定光密度,結(jié)果見圖7。由圖7可以看出,經(jīng)3kD超濾后的烏雞肉蛋白功能肽溶液,經(jīng)10%乙醇洗脫后出現(xiàn)兩個峰,分別在100min和250min時出現(xiàn),在100min時出現(xiàn)的峰I的強度大,250min時出現(xiàn)的峰II強度較小。由此看出,經(jīng)3kD濾膜超濾后的功能肽可能是由兩種類型結(jié)構(gòu)相近的肽組成。3結(jié)論3.1采用氯化鈉酸鈉為保險絲固定胰蛋白酶的最佳工藝條件海藻酸鈉濃度4%、加酶量10%、pH7.5、