熒光猝滅法的應(yīng)用

熒光猝滅法在蛋白相互作用中的應(yīng)用2012年04月21日熒光猝滅法熒光猝滅廣義上說，是指任何可以使熒光強(qiáng)度降低的作用。但狹義的定義僅指由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。這種使熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑猝滅過程可能發(fā)生于：猝滅劑與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用——?jiǎng)討B(tài)猝滅也可能是發(fā)生于猝滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子之間的相互作用——靜態(tài)猝滅動(dòng)態(tài)猝滅在動(dòng)態(tài)猝滅過程中，熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過與猝滅劑分子的碰撞作用，以能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制或電荷轉(zhuǎn)移的機(jī)制喪失其激發(fā)能而返回基態(tài)。動(dòng)態(tài)猝滅效率受到熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的壽命和猝滅劑的濃度控制。通過公式推導(dǎo)得Stern-Volmer方程式：F0/F=1+KsV[Q]=1+Kqτ0[Q]KsV:動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)——反映了生物大分子與熒光猝滅劑分子彼此擴(kuò)散和相互碰撞到達(dá)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)的量效關(guān)系；Kq:動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)——反映了體系中分子的彼此擴(kuò)散和相互碰撞對(duì)生物大分子熒光壽命衰減速率的影響。τ0：為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命KsV=Kqτ0靜態(tài)猝滅在靜態(tài)猝滅的特征是猝滅劑與熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，生成不發(fā)光的基態(tài)化合物，這種基態(tài)復(fù)合物吸收光子后并不發(fā)射光子，而是很快返回到基態(tài)。

推導(dǎo)公式：

F0/F=1+Ks[Q]Ks：靜態(tài)猝滅常數(shù)雙倒數(shù)公式*：

此上公式適用于配合比為1:1的情況下。對(duì)于多結(jié)合位點(diǎn)的生物大分子有*：準(zhǔn)確區(qū)分動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅*：對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，熒光物質(zhì)的吸收光譜一般不會(huì)改變；而靜態(tài)猝滅形成的基態(tài)配合物往往會(huì)導(dǎo)致吸收光譜的改變；動(dòng)態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散，因此熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)將隨溫度的升高而增大，而對(duì)于靜態(tài)猝滅，溫度升高則導(dǎo)致基態(tài)配合物穩(wěn)定性下降，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)將隨溫度的升高而減小；對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，猝滅劑的存在會(huì)縮短熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命；而對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅劑的存在則并不改變熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命。各類熒光猝滅劑最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0x10-10L·mol-1；生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s；根據(jù)KsV的值可求出Kq的大小，如果所求得的Kq值遠(yuǎn)大于2.0x10-10L·mol-1，則此猝滅過程為靜態(tài)猝滅。應(yīng)用——研究氧氟沙星與人血清蛋白相互作用*

先做反應(yīng)的動(dòng)態(tài)猝滅的Stern-Volmer曲線，根據(jù)直線的斜率計(jì)算出KsV。

根據(jù)公式KsV=Kqτ0，進(jìn)而得出Kq，遠(yuǎn)大于2.0x10-10L·mol-1，判定反應(yīng)是靜態(tài)猝滅過程。再通過多結(jié)合位點(diǎn)的生物大分子靜態(tài)猝滅推導(dǎo)公式：根據(jù)直線斜率確定結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=0.9≈1確定反應(yīng)屬于靜態(tài)猝滅過程，進(jìn)而運(yùn)用靜態(tài)猝滅雙倒數(shù)公式求解結(jié)合常數(shù)：得到K=1.44×105(mol/L)-1謝謝