用帶有STR的基因位點區(qū)別廣東和福羅里達州的柑橘黃龍病菌種群

.頁眉.頁腳..用帶有STR（短串聯(lián)重復序列）的基因位點區(qū)別廣東和福羅里達州的柑橘黃龍病菌種群摘要黃龍病是一種具有極大破壞性，并且威脅全球柑橘生產(chǎn)。這種疾病首先在100年前中國的廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)，在2005年的美國的福羅里達州又發(fā)現(xiàn)了。與黃龍病相關(guān)的柑橘黃龍病菌在世界多處柑橘種植園區(qū)，包括廣東和福羅里達州。全球的流行病-黃龍病，這種疾病的管理，都依賴于對黃龍病病菌在世界不同區(qū)域的了解。在本研究中，我們在黃龍病病菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了小的串聯(lián)重復序列，并且比較分析了廣東和福羅里達州的的這種病菌中TRNs（串聯(lián)重復序列編號）。通過分析這些編號，我們發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)的細菌種群不同于福羅里達州的種群。廣東地區(qū)的種群TRN絕大多數(shù)為7，頻率為47.6%。福羅里達州的種群相對的TRN絕大多數(shù)為5，頻率為84.4%。TRNs從3到16不等。這些TRNs值9,10,11,12的明顯缺乏，將這些細菌性菌株分成兩組：TRNs<10和TRNs>10兩種。在福羅里達州，TRN<10的菌株大多數(shù)分布在感染黃龍病的國家。TRN>10株(6/109,或5.5%)是在佛羅里達中部地區(qū)發(fā)現(xiàn)的。這是第一份關(guān)于亞洲和北美黃龍病病菌比較的文件，而且證明了，兩種不同地域分布的黃龍病病菌的基因型在福羅里達州的存在的可能性。關(guān)鍵字：基因型變異黃龍病是一種具有極大破壞性，并且威脅全球柑橘生產(chǎn)。這種疾病首先在19世紀末中國的廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)，是一種地方病。黃龍病最近在福羅里達州報導過，引起了美國柑橘產(chǎn)業(yè)的關(guān)注。一個α-變形菌，黃龍病病菌首先從印度的感染黃龍病的樹中鑒定出來。自此以后，在廣東和福羅里達州發(fā)現(xiàn)很多參與黃龍病的病菌。不同地區(qū)關(guān)于黃龍病的柑橘病菌的多樣性對于這種疾病的管理有全球的流行病影響意義。關(guān)于細菌菌群的多樣性的了解有利于提高黃龍病管理策略的有效性，經(jīng)濟價值和穩(wěn)定性，來減輕損失。目前，有限的生物和基因組的數(shù)據(jù)可以利用的，在劃分不同地理區(qū)域起源的病菌種群多樣性。分類學上，黃龍病病菌被一個在16srRNA上的印記序列定義。在這個基因組位點上病菌的變異是有限的，并且這個位點也不適合菌株的變異。其他的基因位點被用于細菌的鑒定，包括核糖體RNA蛋白的β操縱子和外膜蛋白基因。類似于這些16srRNA位點，核糖體RNA蛋白基因是高度保守的，并且不展現(xiàn)菌株的多樣性?；诰酆厦告準椒磻?yīng)(PCR），外膜蛋白位點的限制性片段長度的多態(tài)性，Bastianel等人從10個不同的國家分離了黃龍病病菌的菌株，雖然只有1。2個菌株代表每個地區(qū)。Deng等人最近在外膜蛋白基因內(nèi)進行單核苷酸多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)廣東的菌株是泰國和尼泊爾分離來的，而不是來自菲律賓和中國北海。Tomimura等人分析了細菌噬菌體種類，DNA聚合酶序列，發(fā)現(xiàn)在南亞的病菌種群中有三個簇，一個是和印尼的種群相關(guān)兩，另外兩種和地域的分布沒有關(guān)聯(lián)。到目前為止，我們并沒發(fā)現(xiàn)中國和美國黃龍病菌的相對的基因評價。一個重要的問題是適當?shù)姆肿訕擞浀男枰?。最近，有一個鳥槍法的病菌全基因序列被報導。這就可以獲得更多的基因位點，來表征細菌種群的多樣性。在有苛養(yǎng)木桿菌時，病原引起葡萄的皮爾斯病和杏葉的葉片枯黃病，分析導致位點識別的基因組序列，PD0218，一個絲氨酸蛋白酶含有串聯(lián)重復序列ACDCCA。這個串聯(lián)重復序列的編號在基因組位點中是高度可變的，導致從葡萄和杏葉中分離到高相似的G-基因型菌株。在本研究中，我們采取了類似的策略去表征從廣東和福羅里達州采到的病菌的多樣性。我們首先確定在病菌中基因組中含有的短串聯(lián)重復序列的位點。研究在這個位點中得TRNs表明，廣東的細菌種群明顯不同于福羅里達州的。TRN的多樣性在生物學和流行病學中得應(yīng)用進行了討論。材料和方法細菌的來源在本研究中，黃龍病病菌的菌株通過從有癥狀的葉子中提取的細菌DNA來描述和確定。帶有黃龍病表樣的柑橘葉子標本取自三個不同實驗室:(1)廣東，中國，華南農(nóng)業(yè)大學(2)美國佛羅里達州農(nóng)業(yè)與消費局植物產(chǎn)業(yè)處(FDACS-DPI),蓋恩斯維爾(3)美國食糖公司/南方柑橘園林，(USSCSGC),克萊維斯頓，弗羅里達。華南農(nóng)業(yè)的標本在2007年從廣東省四個縣的六個樹叢中收集的。在這六個地區(qū)，有三個地區(qū)是在省的西部，是目前最主要的柑橘生產(chǎn)區(qū)，在這里黃龍病是傳統(tǒng)的地方病。柑橘包括柚子，橙子，柑橘，枸桔。在弗羅里達，農(nóng)業(yè)與消費局植物產(chǎn)業(yè)處(FDACS-DPI)的標本是在2009年的2月到2008年的3月從主要的柑橘生產(chǎn)區(qū)的29個國家獲得的。主要包括礁萊檬，酸橙，檸檬，橙子，枸桔，廣西沙柑，葡萄柚，和桔柚。美國食糖公司/南方柑橘園林(USSCSGC)的標本在2007年的7月到2008年的2月期間，在美國南部的7個城市的橙子中提取的。DNA的提取在廣東，標本的獲得是先將柑橘的葉主脈切除，利用前邊提到的溴化方法將DNA提取出來。美國佛羅里達州農(nóng)業(yè)與消費局植物產(chǎn)業(yè)處(FDACS-DPI)的標本是先取80~100mg的葉主脈和葉柄長枝條，美國BioSpec公司的小型珠磨器和植物DNeasy提取系統(tǒng)。美國食糖公司/南方柑橘園林(USSCSGC)的標本是按前邊描述的過程提取的除了將DNA顆粒溶解在500ul的蒸餾水中。黃龍病病菌用OI1/OI2c和ITSAf/ITSAr兩種設(shè)計引物進行PCR擴增來鑒定。把微生物免疫的DNA材料送到位于圣約魁谷農(nóng)業(yè)科學中心的研究實驗室，美國的農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部門，位于加利福尼亞州的parlier市，加拿大等部門檢測。對細菌種群分析的引物和PCR流程黃龍病菌株psy62的序列從國家生物技術(shù)信息的基因庫中獲得。將CLIBASIA_01645基因選出來的原因是因為串聯(lián)重復結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。串聯(lián)重復序列CLIBASIA_01645的引物是用引物3軟件設(shè)計的。LapGP-1f和LapGP-1r的獲得，它們對黃龍病病毒的特異性是在電腦中用BLASTn程序?qū)Ρ菺enBank數(shù)據(jù)庫檢測到的，并且這個數(shù)據(jù)庫包括許多著名的柑橘病原體。引物根據(jù)前邊提到的過程是用于DNA的擴增。首先反應(yīng)體系在TaKaRa公司熱啟動Taq系統(tǒng)中進行，含有25-μl混合物，其中含有2.5μl的10倍DNA聚合酶的緩沖,2.5μl2.5mMdNTPs,1μl的模板DNA,TaqDNA聚合酶0.2μl濃度為5U/μl和18.3μl的水。一個MJResearch公司DNAEngineTetrad2pcr儀設(shè)計首先1min的變性，再在以下條件下循環(huán)35個周期：96℃的情況下30秒，55℃30秒，72℃30秒。在最后一個循環(huán)后在72℃條件下延伸4分鐘。將pcr的產(chǎn)物放在1.5%的瓊脂凝膠中電泳，在紫外燈照射下經(jīng)過溴化乙錠染色觀察結(jié)果。DNA的測序和分析pcr的擴增產(chǎn)物用pcr中使用得引物在兩個方向進行測序，利用的是BigDyeTerminatorv3.1循環(huán)測序試劑盒3130xl基因分析儀。手動計算串聯(lián)重復序列的數(shù)量。不同TRN基因型的頻率分別計算。細菌種群的區(qū)別利用統(tǒng)計學的χ2檢驗和Wilcoxonsigned-rank檢驗。結(jié)果總共，有174株黃龍病病菌進行了分析，65株來自廣東?。?株柚子，19株甜橙，33株柑桔，2株和6株枸桔）和109株來自弗羅里達。在弗羅里達的菌株中，54株由佛羅里達州農(nóng)業(yè)與消費局植物產(chǎn)業(yè)處(FDACS-DPI)取自29個國家，包括南部，中部和北部地區(qū)，55株由美國食糖公司/南方柑橘園林(USSCSGC)取自南部弗羅里達的7個國家。引物BLASTn搜索經(jīng)鑒定符合了黃龍病CLIBASIA_01645序列。所有帶有LapGP-1f/LapGP-1r引物設(shè)置的PCR陽性標本對帶有引物設(shè)置ITSAf/ITSAr和OI1/OI2c都是陽性的。帶有黃龍病特異性引物的弱擴增與利用引物位點LapGP-1f/LapGP-1r的微弱擴增關(guān)系密切。設(shè)計引物LapGP-1f/LapGP-1r特異性擴增來自黃龍病毒的DNA。在多數(shù)情況下,設(shè)計引物LapGP-1f/LapGP-1r產(chǎn)生類似的大約700bp的擴增子。同時,較大的擴增資也可以看到。核苷酸的序列分析證明了LapGP-1f/LapGP-1r擴增資的多樣性。含有CLIBASIA_01645位點的黃龍病菌株psy62包含5個AGACACA短串聯(lián)重復序列。經(jīng)過對174株菌株的檢測顯示這個位點的TRNs值在3到16之間變動。在佛羅里達菌株,TRN值為5(TRN5)的菌株有84.4%的頻率,其次是TRN值為4(TRN4)的占有相對較小的頻率為4.5%。相比之下,在廣東株中TRN值為7(TRN7)是最常見的(47.6%),其次是TRN6(TRN6)頻率為29.2%。由于存在一些較小的預期值在χ2測試中，數(shù)據(jù)表1被分成三組類別:TRN≤5、TRN=6、TRN≥7。測試結(jié)果表明TRNs在廣東和佛羅里達種間分布頻率的有顯著差異(P<0.001)。結(jié)果Wilcoxonsigned-rank測試九個TRN類別(表1)也顯示兩組種群之間也存在顯著性差異(P<0.001)。分布在不同柑橘寄主的黃龍病毒TRNs值的在如下所示在圖2中。TRN5TRN7甜橘(C.Sinensis),作為一個例子。在85個佛羅里達甜橙的病毒株里,73例(85.6%)是TRN5,沒有一個是TRN7(0%)。在19株廣東甜橙病毒株里,5例(26.3%)是TRN5，7例(36.8%)是TRN7。顯然,甜橘對于鑒別TRN變種研究沒有顯著效果?；蛐蚑RN9TRN10TRN11TRN12的缺乏將兩地的黃龍病菌株分離成兩組(表1):是一種大型TRN集團(TRN>10[TRN>10])和一個小TRN集團(TRN<10[TRN<10])。在廣東種群中，2株(3.0%)TRN>10株被檢測到了,相對的63菌株TRN<10(平均=6.4±0.9)?？傊?6例(11.1%)TRN>10菌株存在于FDACS-DPI樣品,所有這些都是來自佛羅里達中部，并且48株菌株TRN<10(平均=4.9±0.5)。取自USSCSGC的菌株樣本都是TRN<10(平均=5.0±0.3)。廣東菌株較大的標準偏差表明在廣東的黃龍病菌種群比佛羅里達更多樣化。廣東和佛羅里達州兩地區(qū)的TRN>10標準偏差沒有預測到是由于小尺寸的樣本量沒有拿來討論。CLIBASIA_01645是作為一種噬菌體阻遏蛋白C1注解的(11)。這個基因長672bp(223個氨基酸)。串聯(lián)重復的核苷酸位置區(qū)域橫跨從401到436。一個S24LexA-like肽酶部位被預測是由429到654核苷酸位置編碼的。因為重復單元(AGACACA)在CLIBASIA_01645有7個bp,只添加或者刪除三個單元(即21個核甘酸，編碼RHKTQDT)才有能保證在框架中的基因的翻譯。帶有TRNs4、6、7的序列導致在468、462和486核苷酸位分別產(chǎn)生肽端。只有三株來自廣東的框架中變異株帶有TRN值為8的序列(表1)。在佛羅里達沒有鑒定出框架中的變體菌株。討論多年以來，自從第一次描述黃龍菌，黃龍病菌種群的多樣性成為一個研究的挑戰(zhàn)?；趓rn或rpl序列區(qū)分不同的地理源頭的黃龍病菌株，對它們的基因組變化性檢測,幾乎毫無成效(7)。Omp位點的變異僅限于幾種SNPs(1，7)，對種群分析不夠有效和充分。在本研究中,我們參考以往的成功——區(qū)分密切相關(guān)的細菌菌株(5)和鑒定黃龍病毒基因組中一個帶有串聯(lián)重復序列的位點。這里提供的數(shù)據(jù)表明,這里提供的數(shù)據(jù)表明,廣東和佛羅里達種群種間分布頻率的TRNs是不同的。不同TRN基因型的共存表明黃龍病毒包含串聯(lián)重復序列的發(fā)生的機制。在細菌中TRN變化的分子機制,通常認為與DNA滑脫(2，21，22)相關(guān)并且伴隨著細菌的環(huán)境適應(yīng)(3)?；蛐蚑RN9TRN10TRN11TRN12的缺乏(見表1,圖2)表明,可能有在黃龍病毒中存在TRN變化的兩大機制。其中一種牽涉到在給定的時間一個單位的變化,導致了在TRN>10和TRN<10基因型中連續(xù)TRN變化。另一個機制涉及幾個單元的復制或三體化，創(chuàng)建一個TRN>10菌株從一個TRN<10菌株。雖然真正的機制的需要得到證實,它還有待確定什么時候(頻率)(例如,其它在寄主植物、昆蟲媒介,這樣在)在哪里TRN發(fā)生變化。此外,廣東和佛羅里達存在主要的黃龍病毒TRN類型顯示出對于不同細菌種群TRN7和TRN5的基因型的選擇壓力作用(未知的生物因素或者無機因素)。在廣東的黃龍病毒種群較在佛羅里達州的多樣化,與目前的了解——HLB已經(jīng)廣東要比在佛羅里達州存在時間長得多的是一致的。這也支持了黃龍病菌株是被引進到佛羅里達的結(jié)論。應(yīng)該指出只鑒定了八菌TRN>10的黃龍病的菌株。這些菌株可能形成一個第二個比較局限性菌株群,但在這樣一個明確的種群形成之前需要的分析更多的的菌株。我們推測當前佛羅里達州的黃龍病種群至少源自兩個不同的地方。這TRN<10株菌株,主要是通過TRN5菌株,可能從源自一個未知的地區(qū),然后通過柑橘樹在整個佛羅里達傳播。TRN>10的菌株可能后來引入佛羅里達中部地區(qū),就像限制性傳播提到的。另外，兩組基因型群可能就是在同一時間或不同的時間引入佛羅里達中部地區(qū),但以不同的速度傳播。在任何情況下,都需要進一步的證明，而且，細菌引入次數(shù)依然是未知的。雖然TRN是一個菌株遺傳變異非常靈敏的指標,但應(yīng)該注意的是,選擇的串