動(dòng)物源性食品中裂頭蚴檢測(cè)方法

I動(dòng)物源性食品中裂頭蚴檢測(cè)方法范圍本文件規(guī)定了動(dòng)物肌肉組織中迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴目檢、顯微鏡檢和PCR檢測(cè)方法的技術(shù)要求。本文件適用豬、雞、蛙、蛇、魚(yú)等動(dòng)物的產(chǎn)品及其制品中迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴的檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣WS/T230-2002臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）。PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline）。TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（TrisAcetate-EDTABuffer）。DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）cox1：線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（Mitochondrialcytochromecoxidasesubunit1）基因。EB：溴化乙錠（EthidiumBromide）。樣品的采集、保存和運(yùn)輸5.1樣品的采集根據(jù)不同動(dòng)物的具體情況，每頭動(dòng)物采集胴體一個(gè)部位或多個(gè)部位的肌肉或組織。豬：采集腹膜下板脂，膈肌腳、腹壁肌、胸肌、腰肌、腎周圍連接脂肪的肌肉組織，尤其是皮下、腹膜下、腹壁肌肉及股部肌肉結(jié)締組織中含有的外觀似脂肪、呈蜷曲狀、綠豆至黃豆大小、乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀的組織，以及出血部位的肌肉組織，每份樣品不少于100克。雞、蛙：采集腹部、股部、嗉囊周圍的皮下，胸、腹壁、胃、大腿、前肢、背等部位肌肉組織、肌肉近脂肪組織，以及腸系膜中含有的外觀似脂肪、呈蜷曲狀、綠豆至黃豆大小、乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀的組織，每份樣品不少于100克；或按GB/T18088的規(guī)定隨機(jī)選取整個(gè)動(dòng)物。蛇：采集尾部、肛門(mén)以上的背部肌肉及皮下，外觀似脂肪、呈蜷曲狀、綠豆至黃豆大小，尤其乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀的組織，以及肌肉附近的脂肪組織，每份不少于20克；或按GB/T18088的規(guī)定隨機(jī)選取整個(gè)動(dòng)物。魚(yú)、蝦：采集體表、鱗和鰭，以及皮下肌肉中含有的外觀似脂肪、蜷曲狀、綠豆至黃豆大小、乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀的組織；或取肌肉樣品，每份不少于20克；或按GB/T18088的規(guī)定隨機(jī)選取整個(gè)動(dòng)物。5.2樣品的運(yùn)輸和保存樣品保護(hù)和運(yùn)送按GB/T18088的規(guī)定執(zhí)行。樣品的制備與保存除按GB/T18088的規(guī)定執(zhí)行外，采集的樣品，當(dāng)天檢查的，存放于2℃~8℃條件下；1月以內(nèi)檢查的，存放于-20℃，疑似蟲(chóng)體亦可保存于70%酒精中；超過(guò)1個(gè)月的，存放于-80℃冰箱，疑似蟲(chóng)體亦可保存于70%酒精中。6檢查方法6.1目檢法6.1.1主要儀器設(shè)備6.1.1.1外科手術(shù)剪。6.1.1.2不銹鋼鑷子。6.1.1.3不銹鋼、鋁合金或塑料肉樣盤(pán)，內(nèi)有格子并編號(hào)。6.1.1.4尺子：最小刻度0.1cm。6.1.2檢查方法6.1.2.1組織樣品仔細(xì)觀察樣品中，是否存在外觀似脂肪、呈蜷曲狀、綠豆至黃豆大小的組織，進(jìn)一步觀察是否呈乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀，將這些組織用剪刀仔細(xì)挑出，觀察其形態(tài)、測(cè)量其大小。6.1.2.2動(dòng)物樣品按5.1要求采集組織樣品。檢查樣品中，是否存在外觀似脂肪、呈蜷曲狀、綠豆至黃豆大小的組織，進(jìn)一步觀察是否呈乳白色或略帶黃色、筋膜樣長(zhǎng)線條狀，將這些組織用剪刀仔細(xì)挑出，觀察其形態(tài)、測(cè)量其大小。6.1.3結(jié)果判定若發(fā)現(xiàn)存在乳白色或淡黃色，長(zhǎng)帶形，呈白棉線狀，長(zhǎng)0.5cm~80.0cm，寬0.065cm~1.0cm；頭端膨大，呈匙狀，頂端中央有一孔向內(nèi)凹陷；蟲(chóng)體不分節(jié)，體表具有不規(guī)則的橫紋；末端鈍圓；剛采集時(shí)不斷蠕動(dòng)（見(jiàn)附錄A）。一份樣品中任一部位發(fā)現(xiàn)有類似上述裂頭蚴或殘斷裂頭蚴，可判定為迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴疑似感染。若樣品各部位均未發(fā)現(xiàn)上述裂頭蚴或者裂頭蚴的殘斷體，則判定為陰性。疑似蟲(chóng)體及殘斷蟲(chóng)體的鑒定，需采用顯微鏡檢法或PCR法檢測(cè)確診。6.2顯微鏡檢法6.2.1主要儀器及材料6.2.1.1外科手術(shù)剪。6.2.1.2不銹鋼鑷子。6.2.1.3不銹鋼、鋁合金或塑料肉樣盤(pán)，內(nèi)有格子并編號(hào)。6.2.1.4載玻片。6.2.1.5注射器針頭：7×8，市售商品。6.2.1.6生物顯微鏡或體視顯微鏡。6.2.2試劑生理鹽水（見(jiàn)附錄B）。6.2.3操作方法目檢法發(fā)現(xiàn)的疑似裂頭蚴蟲(chóng)體或裂頭蚴殘斷體樣品，可采用顯微鏡檢法確診。將疑似裂頭蚴蟲(chóng)體、組織或疑似裂頭蚴殘斷體置于載玻片上，滴加適量生理鹽水，放置在生物顯微鏡或體視顯微鏡下，低倍（10倍×10倍）下觀察蟲(chóng)體外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。再用注射器針頭的針尖劃破蟲(chóng)體，觀察從破損處外流出的組織類型。6.2.4結(jié)果判定若發(fā)現(xiàn)存在大小、顏色和形態(tài)同6.1.3的疑似蟲(chóng)體，生物顯微鏡下觀察，疑似蟲(chóng)體的前端背腹各有1條縱行的吸槽，蟲(chóng)體不分節(jié)，體表有凹凸不均的橫皺褶，尾部鈍圓；體視顯微鏡下觀察，疑似蟲(chóng)體頂端中央有一明顯向內(nèi)凹陷，成隧道狀，并向后延伸形成盲管；蟲(chóng)體內(nèi)實(shí)質(zhì)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)器官和空腔結(jié)構(gòu)，調(diào)整焦距，出現(xiàn)數(shù)目較多的圓形或不規(guī)則的石灰小體，或存在排泄小管；用針頭劃破蟲(chóng)體后，在400倍顯微鏡下，有折光性強(qiáng)、無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、比裂頭蚴體細(xì)胞大、呈圓形或橢圓形盤(pán)狀物的石灰小體流出，可判定為裂頭蚴陽(yáng)性。若樣品中未發(fā)現(xiàn)上述形態(tài)的裂頭蚴，則判定為陰性。6.3PCR法6.3.1主要儀器和材料6.3.1.1儀器6.3.1.1.1PCR基因擴(kuò)增儀。6.3.1.1.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速大于15000r/min。6.3.1.1.3低速大容量離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速大于3000r/min。6.3.1.1.4微量可調(diào)移液器：2μL、10μL、20μL、200μL、1000μL。6.3.1.1.5核酸電泳儀。6.3.1.1.6核酸電泳槽。6.3.1.1.7凝膠成像分析系統(tǒng)。6.3.1.1.8組織研磨儀。6.3.1.1.9高壓蒸汽滅菌器。6.3.1.1.10水浴鍋6.3.1.1.11超凈工作臺(tái)6.3.1.1.12紫外分光光度儀6.3.1.2材料6.3.1.2.1外科手術(shù)剪。6.3.1.2.2不銹鋼鑷子。6.3.1.2.3一次性PE手套或乳膠手套。6.3.1.2.4壓舌板或玻棒。6.3.2.1.5燒杯：100mL。6.3.2.1.6陶瓷珠或不銹鋼珠（直徑2mm~10mm）。6.3.2.1.7離心管：1.5mL、2.0mL、15.0mL、50.0mL。6.3.2.1.8200μLPCR管。6.3.2試劑6.3.2.1磷酸鹽緩沖液（PBS）（見(jiàn)附錄B）。6.3.2.21×TAE（見(jiàn)附錄B）。6.3.2.310mg/mL溴化乙錠（EB）（見(jiàn)附錄B）或同類核酸染料。6.3.2.4基因組DNA提取試劑盒：市售產(chǎn)品。6.3.2.5胃蛋白酶消化液：市售產(chǎn)品。6.3.2.6DNA聚合酶：市售產(chǎn)品。6.3.2.710×PCRBuffer：市售產(chǎn)品。6.3.2.82.5mmol/LdNTPs（含MgCl2）：市售產(chǎn)品。6.3.2.9引物（上、下游引物F1和R1的濃度分別配成100μmol/L，引物序列見(jiàn)附錄C）。6.3.2.10100bp~2000bpDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：市售產(chǎn)品。6.3.2.111%瓊脂糖凝膠（見(jiàn)附錄B）。6.3.2.126×加樣緩沖液：市售產(chǎn)品。6.3.2.13質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)裂頭蚴：陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)裂頭蚴為曼氏迭宮絳蟲(chóng)（Spirometramansoni）、其它種類的迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（如S.erinaceieuropaei、S.decipiens、S.folium等）或其片段，長(zhǎng)度在0.2cm~0.5cm。陰性質(zhì)控對(duì)照為不含迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴的同種類肌肉或組織。6.3.3操作步驟6.3.3.1DNA抽提取出新鮮、凍存或保存于70%酒精中的肌肉、組織或疑似裂頭蚴蟲(chóng)體樣品，用PBS反復(fù)沖洗5-6次，用無(wú)菌鑷子取出疑似蟲(chóng)體（陽(yáng)性對(duì)照為裂頭蚴蟲(chóng)體）的一部分（0.2cm~0.5cm長(zhǎng)），或根據(jù)采集的樣品大小進(jìn)行多點(diǎn)取樣（至少3個(gè)點(diǎn)），每個(gè)點(diǎn)取0.1g，混合后用滅菌剪刀將蟲(chóng)體（或組織）剪碎，置于1.5mL的小離心管中。加入2顆~3顆陶瓷珠或不銹鋼珠，用組織研磨儀研磨。研磨好的樣品加入400μLPBS和40μL蛋白酶K，充分混勻后，放置于56℃水浴鍋消化2h~3h，至溶液澄清，其間每30min混勻1次。消化完成的蟲(chóng)體懸浮液，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蟲(chóng)體DNA提取。測(cè)定并記錄提取的DNA溶液在260nm和280nm的吸光度（OD值），OD260/OD280值應(yīng)為1.7~2.0，或質(zhì)量符合檢測(cè)要求。將DNA溶液適當(dāng)稀釋或濃縮，使其OD260值在0.1~0.8的區(qū)間內(nèi)。以1OD260值相當(dāng)于50mg/LDNA濃度，計(jì)算DNA的濃度。將提取的基因組DNA置于-20℃冰箱保存。6.3.3.2PCR擴(kuò)增采用PCR方法，對(duì)待檢樣品提取的基因組DNA進(jìn)行跌宮絳蟲(chóng)裂頭蚴線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（Mitochondrialcytochromecoxidasesubunit1,cox1）基因部分序列的擴(kuò)增，引物F1和R1序列見(jiàn)附錄C，擴(kuò)增片段大小約為409bp~448bp，參考序列見(jiàn)附錄C。每次檢測(cè)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照模板為6.3.2.13節(jié)中所列的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)裂頭蚴，按照6.3.3.1所列方法提取的DNA，濃度為25mg/L~50mg/L的迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴基因組DNA樣品；陰性對(duì)照模板為2g6.3.2.13節(jié)中所列的陰性質(zhì)控對(duì)照樣品按照6.3.3.1所列方法提取的DNA，濃度為25mg/L~50mg/L。擴(kuò)增采用25μLPCR反應(yīng)體系，按下列方法配制：10×PCRBuffer（含MgCl2）2.5μLdNTPMixture（2.5mmol/L）2μLF1（10μmol/L）1μLR1（10μmol/L）1μLDNA聚合酶（1.0U/μL）0.5μLDNA模板2μLPCR用水16μLPCR擴(kuò)增參數(shù)：94°C預(yù)變性5min；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。6.3.3.3瓊脂糖凝膠電泳用1×TAE緩沖溶液配制1.2%瓊脂糖凝膠，每100mL凝膠中加入5μLEB（見(jiàn)附錄C）或同類核酸染料。取PCR產(chǎn)物5μL，添加適量的DNA上樣緩沖液，在1.2%瓊脂糖凝膠中以1V/cm~10V/cm凝膠的電壓下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。6.3.4結(jié)果判定6.3.4.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)按6.3.3.2方法擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條大小約為409bp~448bp條帶、陰性對(duì)照無(wú)條帶時(shí)判定為試驗(yàn)有效。6.3.4.2擴(kuò)增結(jié)果判讀陽(yáng)性：被檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物泳道出現(xiàn)一條大小約為409bp~448bp條帶時(shí)（見(jiàn)附錄C），判為跌宮絳蟲(chóng)裂頭蚴核酸陽(yáng)性。陰性：被檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物泳道沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶，經(jīng)重復(fù)PCR檢測(cè)仍未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶時(shí)，判為跌宮絳蟲(chóng)裂頭蚴核酸陰性。7綜合判定受檢樣本經(jīng)顯微鏡檢法和PCR法任一項(xiàng)檢測(cè)出陽(yáng)性，判為該樣品陽(yáng)性。附錄A（資料性）跌宮絳蟲(chóng)裂頭蚴參照?qǐng)DA.1肌肉組織及皮下寄生的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴參照?qǐng)D蛙皮下及肌肉組織中寄生的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴見(jiàn)圖A.1。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——單側(cè)蛙肌肉組織中的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）B——兩側(cè)蛙肌肉組織中的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）C——一側(cè)蛙肌肉組織中寄生2條曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）D——皮下組織中寄生的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）E——一側(cè)蛙肌肉組織中寄生3條曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）F——蛙背側(cè)肌肉組織中寄生的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴（箭頭所示）圖A.1蛙肌肉組織中的迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴A.2從蛙肌肉組織中分離的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴參照?qǐng)D蛙肌肉組織中分離的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴見(jiàn)圖A.2。。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴，蘇木精染色，6.8×B——曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴頭部，蘇木精染色，20×C——正在向蛙肉進(jìn)行趨化運(yùn)動(dòng)的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴，蘇木精染色，6.8×D——褶皺聚攏時(shí)的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴，蘇木精染色，20×圖A.2蛙肌肉組織中分離的曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴附錄B（資料性）試劑的配制B.1生理鹽水NaCl9.0g加入800mL蒸餾水，用消毒玻棒攪拌溶解，加蒸餾水定容至1000mL，在1.034×105Pa壓強(qiáng)下蒸汽滅菌20min，保存于室溫。B.20.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）NaH2PO4·H2O0.39gNa2HPO4·7H2O1.93gNaCl8.5g加入800mL蒸餾水，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加蒸餾水定容至1000mL，在1.034×105Pa壓強(qiáng)下蒸汽滅菌20min，保存于室溫。B.31×TAE使用液Tris堿242g冰醋酸57.1mLEDTA（0.5mol/L，pH8.0）100mL加蒸餾水定容至1000mL，在1.034×105Pa壓強(qiáng)下蒸汽滅菌20min，使用時(shí)用蒸餾水按1:50稀釋成1×TAE。B.410mg/mL溴化乙錠溴化乙錠1g加蒸餾水定容至100mL，磁力攪拌數(shù)小時(shí)，確保完全溶解，用棕色瓶或鋁箔包好，室溫保存。B.51.0%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1g加1×TAE定容至100mL，在微波爐中加熱融化、混勻，冷卻至55℃，加入10mg/mL溴化乙錠5μL，使?jié)舛葹?.5μg/mL，或適合濃度的其他核酸染料，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，凝固后移去樣品梳，當(dāng)天使用。附錄C（規(guī)范性）引物序列、參考擴(kuò)增片段序列與PCR擴(kuò)增圖C.1PCR擴(kuò)增引物序列JB3：5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’JB4.5：5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’引物參考曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴cox1基因序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段大小約為409bp~448bp，不同種系間基因片段長(zhǎng)度及序列一致性可能有一定程度差異。引物終濃度為0.1μmol/L~2.0μmol/L。C.2曼氏跌宮絳蟲(chóng)裂頭蚴cox1基因擴(kuò)增片段參考序列曼氏跌宮絳蟲(chóng)（Spirometramansoni）DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列（登錄號(hào)MN432157.1）為：