實(shí)時(shí)熒光pcr課件

PCR

_UU、NG、CT測(cè)定

LOREMIPSUMDOLORPCR技術(shù)根本原理

一、定義PCR〔PolymeraseChainReaction〕即聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀侵冈贒NA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?？捎糜诨騽e離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。二、PCR反響的根本過(guò)程①變性〔denaturation〕將模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作準(zhǔn)備。二、PCR反響的根本過(guò)程②退火(annealing)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；二、PCR反響的根本過(guò)程

③延伸〔extension〕DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按A-T、C-G堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原那么，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈。重復(fù)變性--退火--延伸的循環(huán)過(guò)程，就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈〞，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR反響體系的根本成分模板DNA特異性引物DNA聚合酶dNTPMg2+的緩沖液。PCR的反響動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反響步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反響最終的DNA擴(kuò)增量可用Yn＝X*(1＋E)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，E表示平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反響中平均效率達(dá)不到理論值。反響初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，但隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，其對(duì)擴(kuò)增過(guò)程出現(xiàn)負(fù)作用，再加上酶的消耗疲勞，整個(gè)擴(kuò)增將進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或平臺(tái)期，此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)〞，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理：通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反響的進(jìn)行，PCR反響產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖(如圖)。CT值與起始模板的關(guān)系研究說(shuō)明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值〔如圖所示〕。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)別離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。探針熒光技術(shù)原理

將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反響規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反響體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。實(shí)驗(yàn)步驟解脲支原體DNA測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

試劑配制樣本數(shù)〔樣本數(shù)＝待測(cè)標(biāo)本數(shù)+質(zhì)控品5個(gè)+1〕n配制反響液UUPCR緩沖液n×18ul、Mgcl2n×3ul、UU熒光探針n×3ul、Tap酶n×2ul配制，按26ul分裝。解脲支原體DNA測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)本漂洗液200ul→13000rpm離心10分鐘→吸棄上清→參加50ulDNA裂解液→震蕩混勻、溫浴10分鐘→13000rpm離心2分鐘→上樣→低速離心數(shù)秒→全自動(dòng)熒光PCR儀擴(kuò)增程序：50℃-----1分鐘94℃-----2分鐘94℃5秒→60℃30秒〔循環(huán)40次〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果解讀一.PCR出現(xiàn)假陰性原因：1．模板因素：〔1〕模板中含有雜蛋白；〔2〕模板中含有Taq酶抑制劑；〔3〕模板中蛋白質(zhì)殘留，特別是染色體中的組蛋白殘留；〔4〕提取制備模板時(shí)喪失過(guò)多；〔5〕模板核酸變性不徹底。解決：1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;2.提取程序固定,不宜隨意改動(dòng)；3.模板DNA的溶解液應(yīng)固定不變。2．酶失活1.〕酶本身的質(zhì)量問(wèn)題(供給商的問(wèn)題〕；2.〕酶存放時(shí)間太長(zhǎng)；3.〕酶存放方式不當(dāng)，或其他意外原因；4.〕忘記添加Taq酶。3、引物：質(zhì)量；濃度；兩條引物的濃度是否對(duì)稱等。解決：1.選定一個(gè)好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看OD值，稀釋時(shí)更要平衡其摩爾濃度；3.引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長(zhǎng)期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；4.引物設(shè)計(jì)不合理，如長(zhǎng)度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。4、Mg2+濃度：Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響極大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性；濃度過(guò)低那么影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗，出現(xiàn)假陰性。5、物理原因：1.變性溫度低，變性時(shí)間短；2.退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率；3.延伸時(shí)間過(guò)短等。二.PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性原因：1.引物設(shè)計(jì)不適宜。1〕.選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，從而擴(kuò)增出非目的性序列的PCR產(chǎn)物。2〕.靶序列太短或引物太短導(dǎo)致特異性不強(qiáng)。解決：選擇特異性強(qiáng)的區(qū)段設(shè)計(jì)引物。2.靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。解決方法：1.操作時(shí)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管污染環(huán)境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應(yīng)高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應(yīng)一次性使用。3.必要時(shí)，加樣本前，反響管及試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。三.出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶原因：1.引物與靶序列不完全互補(bǔ)，或引物聚合形成二聚體；2.Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多；3.酶的質(zhì)量不過(guò)關(guān)，或加Taq酶的量過(guò)多。解決方法：1.必要時(shí)重新設(shè)計(jì)合成引物；2.減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶；3.降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減小循環(huán)次數(shù)；4.適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法〔94℃變性，65℃左右退火與延伸〕臨床意義——為臨床的診斷與治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)解脲支原體DNA定性解脲支原體在非淋球菌性尿道炎中，有50%是由本病引起的。如果孕婦生殖道帶有解脲支原體，可通過(guò)胎盤感染胎兒引起早產(chǎn)、死胎，分娩時(shí)可引起新生兒呼吸道感染。另外還可導(dǎo)致不孕不育。因此，婦產(chǎn)科普查解脲支原體有很重要的意義。淋球菌DNA定性男性可發(fā)生尿道炎。女性可引起尿道炎及子宮頸炎。不經(jīng)治療或治療不徹底，可致慢性感染。胎兒經(jīng)產(chǎn)道時(shí)，可感染淋病性急性結(jié)膜炎。因此，在淋病的早