ΔFKH基因克隆及功能的研究的開題報告

小鼠Foxp3-ΔPRD/ΔFKH基因克隆及功能的研究的開題報告一、研究背景與意義CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠抑制自身免疫反應(yīng)、預(yù)防自身免疫病發(fā)生，以及維持免疫平衡。FOXP3是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，且其功能域包括PRD（Proline-richdomain）和FKH（Forkheadboxdomain）功能域。其中PRD和FKH對FOXP3定位、活性和作用具有重要的影響。因此，通過研究FOXP3功能域的結(jié)構(gòu)和功能，對于深入了解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分子調(diào)節(jié)機制具有重要意義。該研究擬通過FGF2介導(dǎo)的信號通路，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建小鼠FOXP3基因的PRD或FKH功能域缺失體系，從而探究FOXP3功能域的生物學(xué)特性與機制，為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分子調(diào)節(jié)機制提供新的認(rèn)識與思路。二、研究內(nèi)容1.克隆小鼠FOXP3基因。2.構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染小鼠T細(xì)胞系，激活FGF2介導(dǎo)的信號通路，并進(jìn)行基因編輯。3.應(yīng)用PCR檢測基因編輯效率，并通過Westernblot檢測FOXP3-PRD或FOXP3-FKH功能域缺失對FOXP3蛋白表達(dá)量的影響。4.應(yīng)用熒光染色法分析FOXP3基因功能域缺失后對小鼠Tregs的影響。三、研究方法1.從小鼠T細(xì)胞提取總RNA，并應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行FOXP3基因擴增，構(gòu)建基因載體。2.利用軟件進(jìn)行基因編輯位點設(shè)計，并構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體。3.將CRISPR/Cas9基因編輯載體轉(zhuǎn)染至小鼠T細(xì)胞系，同時添加FGF2介導(dǎo)的信號通路，激活細(xì)胞生長和基因編輯效率。4.應(yīng)用PCR檢測FOXP3基因的編輯效率，并通過Westernblot檢測FOXP3蛋白在細(xì)胞系中的表達(dá)情況。5.應(yīng)用FACS或熒光染色法分析FOXP3基因功能域缺失后對小鼠Tregs的影響。四、研究預(yù)期成果1.成功克隆小鼠FOXP3基因并構(gòu)建基因編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)FOXP3-PRD或FOXP3-FKH基因功能域缺失體系。2.確定FOXP3功能域缺失后對FOXP3蛋白表達(dá)及活性的影響。3.確定FOXP3功能域缺失對小鼠Tregs數(shù)量、表達(dá)、分化及功能的影響。4.為深入了解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分子調(diào)節(jié)機制提供新的認(rèn)識和思路。五、研究時間安排1.第一年：小鼠FOXP3基因克隆和CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建。2.第二年：細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因編輯效率檢測。3.第三年：FOXP3蛋白表達(dá)及活性檢測，小鼠Tregs功能分析。六、研究經(jīng)費預(yù)算本研究預(yù)計經(jīng)費