生物技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)1.主要內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生背景及意義蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)體系蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展及應(yīng)用2.第一節(jié)、蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生背景及意義3.人類科學(xué)史上的三大工程

人類基因組計(jì)劃（HGP）阿波羅登月計(jì)劃

曼哈頓原子計(jì)劃4.GreatExpectation26thJune2000Thefullysequencedhumangenome5.后基因組時(shí)代（postgenomeera）生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。Nature,Science在2001年發(fā)表的兩篇述評(píng)認(rèn)為：蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)的戰(zhàn)略制高點(diǎn)，是人類基因尤其是重要功能基因爭(zhēng)奪戰(zhàn)的重要戰(zhàn)場(chǎng)。

6.Centraldogma7.從DNA

mRNA

蛋白質(zhì)三個(gè)層次的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(Transcriptional

control

)翻譯水平調(diào)控(Translational

control)翻譯后水平調(diào)控

(Post-translational

control

)8.基因與其編碼產(chǎn)物蛋白的非線性關(guān)系

mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn)展，但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4～0.5，mRNA的種類與含量不能代表蛋白質(zhì)的種類與含量。支原體的蛋白質(zhì)數(shù)目較基因多24%，對(duì)于人，蛋白質(zhì)的數(shù)目至少多3倍。蛋白質(zhì)自身特點(diǎn)難以從DNA和mRNA水平得到解答：復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用等9.OnegeneMultipleprotein選擇性剪切翻譯后修飾10.OnegeneMultipleprotein11.傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已無法滿足后基因組時(shí)代的要求生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)。多個(gè)蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級(jí)聯(lián)因果。在執(zhí)行生理功能時(shí)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的，并不象基因組那樣基本固定不變。

大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢(shì)在必行12.蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念蛋白質(zhì)組（Proteome）是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（PROTEin）與基因組（genOME）兩個(gè)詞的雜合,意指proteinsexpressedbyagenome即“一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)生物體的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。熒光染色的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)13.對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)組是：14.GenomeProteomeCell-specificexpressionstressdrugsMetabolicstateCultureconditions蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

15.基因組學(xué)(Genomics)與蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)基因是生物遺傳的載體，蛋白質(zhì)則是生物學(xué)功能的執(zhí)行者一個(gè)生物體僅有一個(gè)基因組，組成機(jī)體的不同細(xì)胞共享有同一個(gè)基因組，但不同細(xì)胞內(nèi)或同一細(xì)胞的不同狀態(tài)、不同時(shí)空條件下蛋白組成不同，因此，基因組只能說明不同生物的差別，而不能說明機(jī)體每個(gè)細(xì)胞之間的差別。人類大多數(shù)疾病不是由于基因突變引起的，許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、蛋白質(zhì)修飾、氨基酸突變等決定疾病的發(fā)生和發(fā)展。16.蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍及意義1.表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究選擇具有重要生物學(xué)意義且已完成DNA測(cè)序的生物體，鑒定出生物體/某種組織（細(xì)胞）所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，建立其蛋白質(zhì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。進(jìn)展較快的領(lǐng)域有難度的領(lǐng)域：估計(jì)人類的蛋白質(zhì)組由50萬個(gè)蛋白質(zhì)組成，真核生物細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)也超出1萬個(gè)2.功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究識(shí)別、鑒定生物體（組織，細(xì)胞）與某一種生理現(xiàn)象或病理過程相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。17.3.重要生命過程或重要疾病的比較蛋白質(zhì)組學(xué)選取重大生命活動(dòng)或重要疾病中幾個(gè)相繼階段，識(shí)別、鑒定其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后從核酸、蛋白質(zhì)水平對(duì)差異蛋白的功能進(jìn)行分析，從而確定重要生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)或疾病的生物標(biāo)志物。4.亞細(xì)胞復(fù)合物和細(xì)胞器蛋白質(zhì)組分析

了解蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞定位。5.識(shí)別、鑒定蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。18.6.藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)不僅是多種致病因子作用于機(jī)體的重要靶分子，也是大多數(shù)藥物的靶標(biāo)。一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明：20世紀(jì)90年代中期，全世界制藥業(yè)用于尋找新藥的靶標(biāo)483個(gè)，其中蛋白質(zhì)占73%，而當(dāng)時(shí)正在使用的藥物共2000種，其中85%都是針對(duì)483種藥靶。

意義：直接研究生命活動(dòng)的執(zhí)行者－蛋白質(zhì)及其表達(dá)模式，能夠更直接地與基因的功能相關(guān)聯(lián)，也更接近揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)。19.第二節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)體系20.分離技術(shù)：雙向電泳技術(shù)、多維色譜技術(shù)鑒定技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)生物信息學(xué)：計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)的三大支撐技術(shù)21.22.概述2DE-MSLC-MS23.

第一：電泳前蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理；

第二：雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，包括凝膠圖譜的分析

第三：蛋白質(zhì)的鑒定及其性質(zhì)和功能的研究。

2DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究24.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖25.一、雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）26.二維凝膠電泳（2-DE）—目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)工作原理根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性：等電點(diǎn)和分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物通過等電聚焦電泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），在兩個(gè)水平上進(jìn)行分離。1975年首先由O’Farrell等創(chuàng)立27.28.特點(diǎn)可分離10～100KDa分子量的蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配29.1.樣品制備

通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。30.樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等

樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度。31.2DE的樣品準(zhǔn)備樣品必須是無鹽（<50mmol/L）及無其它污染物，如無關(guān)試劑、苯環(huán)化合物及核酸等。樣品預(yù)處理包括溶解、變性和還原，使蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)亞基形式存在。典型的樣品裂解液：7m/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、50~100mmol/LDTT、以及40mmol/LTris-base32.去污劑：去除蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、消除電荷效應(yīng)尿素2mol/L硫脲CHAPS還原劑：去除蛋白質(zhì)的二硫鍵，增加溶解性DTT（二硫蘇糖醇）－巰基乙醇TBP（三正丁基膦）33.CHAPS3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonicacid3-(3-(膽酰胺基丙基）二甲氨基）丙磺酸鹽34.蛋白酶抑制劑(ProteaseInhibition)PMSF、EDTA、AEBSF、HighpH去除核酸

DNaseIandRNaseA、Benzonase

35.分步提取法采用三種溶解性能不同的裂解液分步提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)組分，然后分別進(jìn)行雙向電泳分離。各步提取液：①40mmol/LTris-base；②8m/L尿素、4%CHAPS、100mmol/LDTT、40mmol/LTris-base、0.5%的兩性電解質(zhì)；③5m/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%SB3-10、2mmol/LTBP、40mmol/LTris-base、0.5%的兩性電解質(zhì)。36.37.2DGelPrinciplesSDSPAGE38.2.等電聚焦O’Farrell系統(tǒng)：小分子載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度。當(dāng)電壓加在載體兩性電解質(zhì)混合物間時(shí)，高pI的分子移向陰極，低pI的分子移向陽(yáng)極，形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。缺陷

梯度較穩(wěn)定性差，電泳時(shí)易因電滲而出現(xiàn)陰性漂移39.＋－1098765432pHpI＝8.0蛋白質(zhì)pI＝4.0蛋白質(zhì)

等電聚焦的“聚焦效應(yīng)”

在電場(chǎng)中電泳基質(zhì)形成一個(gè)從正極到負(fù)極不斷增大的pH梯度，由于蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向正極移動(dòng)，帶正電荷的蛋白質(zhì)分子向負(fù)極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)到各自的pI處時(shí)，所帶凈電荷變?yōu)榱?，于是停止遷移而留在該位置上。40.pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽(yáng)離子陰離子41.

固相pH梯度等電聚焦

ImmobilizedpHGradient（IPG）

該技術(shù)是在丙稀酰胺凝膠預(yù)聚合時(shí)共價(jià)引入酸堿緩沖基團(tuán)，利用一種偏酸性丙稀酰胺緩沖液和一種偏堿性的丙稀酰胺緩沖液根據(jù)所需pH范圍按比例制成?，F(xiàn)有商品化的多種pH范圍的IPG。42.43.44.IPG優(yōu)點(diǎn)克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等缺點(diǎn)。穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。

尤其可在較窄的pH范圍內(nèi)進(jìn)行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復(fù)性。重現(xiàn)性好上樣量大45.46.47.3.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）第二相的分子量分離：①制膠；②IPG膠在SDS平衡液中還原和烷基化；③第一向膠成分移至第二向膠上；④電泳；⑤蛋白檢測(cè)48.②IPG膠在SDS平衡液中還原和烷基化平衡液：使膠條上的蛋白質(zhì)變性，破環(huán)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及亞基間相互作用SDS:陰離子去污劑，>1mmol/L,結(jié)合使蛋白帶負(fù)電荷過量，在電場(chǎng)作用下，遷移速率主要有分子量決定尿素、還原劑（DTT）、烷化劑（IAA）49.③第一向膠成分移至第二向膠上

最關(guān)鍵步驟注意事項(xiàng)：第一向膠和第二向膠接觸好：避免引入氣泡，封膠均勻：避免二向電泳時(shí)膠條的移動(dòng)50.④SDS電泳垂直板電泳水平超薄膠電泳51.4.蛋白檢測(cè)檢測(cè)某種蛋白是否存在用Westernblotting進(jìn)行分析；顯示蛋白質(zhì)全譜時(shí)多用銀染色法檢測(cè)，或用靈敏度較高的熒光標(biāo)記與同位素標(biāo)記檢測(cè)；當(dāng)雙向電泳蛋白分離后緊跟質(zhì)譜鑒定時(shí)，多用考馬斯亮蘭R-250、Cu染或Zn-咪唑負(fù)性染色法。52.考馬斯亮藍(lán)染色R-250是最常用的蛋白質(zhì)染色方法。R代表紅藍(lán)色，與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)可逆結(jié)合。染色線性范圍可達(dá)1～55ug，靈敏度達(dá)30～100ng。優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，且不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。考馬斯亮藍(lán)染色53.

銀染色

原理：在酸性硝酸銀溶液中蛋白質(zhì)與銀離子發(fā)生作用，然后在堿性pH條件下，銀離子被甲醛還原成銀顆粒沉淀在蛋白質(zhì)上而呈顯棕黑色。

靈敏度最高：可達(dá)1～10ng缺點(diǎn)：操作繁瑣，重復(fù)性不如R－250，且影響后續(xù)的質(zhì)譜分析。54.聯(lián)合使用55.

熒光染料染色

原理：利用結(jié)合于蛋白質(zhì)的熒光染料發(fā)出的熒光來檢測(cè)蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)染色的熒光染料很多，有的共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)上，有的和蛋白質(zhì)形成非共價(jià)結(jié)合。染料：SYPRORuby，靈敏度可達(dá)1～10ng對(duì)糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影響后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。56.Comparisonoffluorescentlabeled2-Dgelwithsilverstaining57.5.圖像分析系統(tǒng)圖像采集硬件和圖像分析軟件Melanie3、PDQuest6.0、Imagemaster2DElit3.10等基本功能

確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的位置、大小、染色深淺、pI和分子量；

圖譜間的比較、差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的確定；

圖譜質(zhì)量的優(yōu)化、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存管理、數(shù)據(jù)庫(kù)分析等內(nèi)容。58.①點(diǎn)的檢測(cè)；②背景校正；③歸一化處理；④點(diǎn)的匹配。

凝膠圖譜分析步驟：59.大規(guī)模蛋白質(zhì)分離技術(shù)—2-DE60.61.62.63.64.2-DE技術(shù)的缺點(diǎn)極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。65.新型非凝膠分離技術(shù)液相色譜法liquidchromatography，LC毛細(xì)管電泳capillaryelectrophoresis，CE66.多維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）

蛋白質(zhì)直接酶解后的肽段混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。多維液相色譜：根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。67.液質(zhì)聯(lián)用儀68.

二維色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（2D-LC-MS/MS）第一維色譜:離子交換色譜；第二維色譜:反相色譜大規(guī)模蛋白質(zhì)分離技術(shù)

—色譜-質(zhì)譜技術(shù)69.二、生物質(zhì)譜與蛋白質(zhì)鑒定70.蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)的鑒定方法主要利用蛋白質(zhì)的各種屬性參數(shù)，如分子量、等電點(diǎn)、序列、氨基酸組成和肽質(zhì)量指紋譜等，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，尋找與這些參數(shù)相符的蛋白質(zhì)。如果在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到，有可能是發(fā)現(xiàn)了新蛋白，進(jìn)一步要進(jìn)行序列分析，合成探針，分離相應(yīng)基因來表達(dá)，進(jìn)一步鑒定這一蛋白質(zhì)。生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組鑒定中起非常重要的作用71.（一）生物質(zhì)譜技術(shù)

（MassSpectrometricTechnology）質(zhì)譜分析法是通過測(cè)定樣品離子的質(zhì)量與電荷比值-質(zhì)荷比(mass/charge，

m/z)來進(jìn)行未知化合物的成分和結(jié)構(gòu)分析的分析方法。特點(diǎn)：所需要的化合物的量很低，10-15g或10-15mol應(yīng)用廣泛：（1）有機(jī)質(zhì)譜法：生物、醫(yī)藥、發(fā)醫(yī)和環(huán)境等；（2）無機(jī)質(zhì)譜法：地球化學(xué)、地質(zhì)礦產(chǎn)和無機(jī)元素分析等。72.73.74.75.蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜鑒定原理：將樣品分子離子化，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)荷比(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測(cè)器收集分離的離子，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。76.質(zhì)譜圖橫坐標(biāo)：m/z(質(zhì)荷比);縱坐標(biāo)：離子相對(duì)強(qiáng)度

77.質(zhì)譜儀構(gòu)成進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析系統(tǒng)離子檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)78.生物質(zhì)譜儀儀器內(nèi)部結(jié)構(gòu)79.1、電離技術(shù)傳統(tǒng)的電離技術(shù)：適應(yīng)于小分子分析技術(shù)電子轟擊電離化學(xué)電離場(chǎng)電離80.新型軟電離技術(shù)特點(diǎn)：使肽段及其碎片離子化的技術(shù)，靈敏度高、快速、能同時(shí)提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復(fù)雜體系。類型電噴霧電離

(electrospray

ionisation，ESI)基質(zhì)輔助激光解吸附電離（matrix

assisted

laser

desorption/ionization，MALDI)81.（1）.電噴霧離子化（electrosprayionization,ESI）電噴霧離子化方法是利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在逆向N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)侖斥力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復(fù)使最終的液滴變得非常細(xì)小呈噴霧狀，這時(shí)液滴的表面的電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物電離并以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。82.83.電噴霧離子化過程84.NanosprayMicrospray微升噴霧源（μl/min

）納升噴霧源（nl/min

）85.86.87.（2）.基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）

原理：將樣品與小分子基質(zhì)（肉桂酸、介子酸及其衍生物）混合共結(jié)晶，當(dāng)用紫外激光（337nm）照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收能量使樣品與基質(zhì)分子解吸并電離。MALDI產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，是目前靈敏度最高的質(zhì)譜儀，適合微量樣品（fmol-amol）的分析。常與飛行時(shí)間質(zhì)量飛行器聯(lián)用88.

SimplifiedschematicofMALDI-TOFmassspectrometry(linearmode)

89.離子化過程90.91.2、質(zhì)量分析器飛行時(shí)間質(zhì)量分析器四極桿質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器92.(1).飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀(Timeofflightmassanalyzer,TOF)

樣品產(chǎn)生的離子在加速電場(chǎng)的作用下獲得相同的動(dòng)能，經(jīng)過一個(gè)真空無電場(chǎng)飛行管道，較輕的離子速度快，較早到達(dá)檢測(cè)器，較重的離子較晚到達(dá)檢測(cè)器，飛行時(shí)間與（m/z）1/2成正比。93.94.95.（2）.四極桿質(zhì)量分析器

（quadrupolemassanalyzer）由四根平行的金屬電極組成，在電極上施加直流電壓和射頻電壓，在四個(gè)電極間形成一個(gè)射頻電場(chǎng)。從離子源出來的離子進(jìn)入射頻電場(chǎng)，只有某種m/z的離子才能通過射頻電場(chǎng)，到達(dá)另一端的檢測(cè)器，其它離子則發(fā)生偏離撞到電極上。96.97.（3）.離子阱質(zhì)量分析器

（Iontrapmassanalyzer）由一個(gè)環(huán)形電極和一對(duì)端蓋電極組成，端蓋電極接地，環(huán)形電極加一個(gè)射頻電壓。從離子源出來經(jīng)加速的離子進(jìn)入離子阱腔，只有特定m/z值的離子在離子阱腔中形成穩(wěn)定的圓周運(yùn)動(dòng)，其它離子則與環(huán)行電極碰撞而被吸走。用射頻電壓進(jìn)行掃描，不同m/z值的離子按順序離開離子阱腔，進(jìn)入檢測(cè)器，依據(jù)射頻電壓可計(jì)算出離子的m/z。98.99.（二）生物質(zhì)譜儀基質(zhì)輔助激光解吸電離－飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）

ESI-Q-MSESI-TOF-MSESI-Iontrap-MS100.串連質(zhì)譜MS/MS（二級(jí)質(zhì)譜）TandemMassSpectrometry母離子子離子101.原理：第一級(jí)質(zhì)量分析器(MS1)獲得所有組分的分子離子峰（母離子），經(jīng)質(zhì)量過濾器挑出需進(jìn)一步分析的母離子，使其進(jìn)入碰撞室，與室內(nèi)充有的碰撞氣體進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解(collision-induceddissociation,CID)，發(fā)生離子-分子碰撞反應(yīng)，產(chǎn)生碎片離子（子離子），再經(jīng)第二級(jí)質(zhì)譜(MS2)進(jìn)行分析。102.色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(tandemMS)聯(lián)用，可在數(shù)十個(gè)pmol的水平檢測(cè)；若利用毛細(xì)管色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，則可在低pmol到高fmol水平檢測(cè)；目前多為酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計(jì)算機(jī)算法的聯(lián)合應(yīng)用鑒定蛋白質(zhì)。103.（三）生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用1.肽質(zhì)量指紋譜鑒定技術(shù)

（PeptideMassFingerprinting，PMF）PMF是指蛋白質(zhì)被識(shí)別特異酶切位點(diǎn)的蛋白酶水解后得到得肽片段質(zhì)量圖譜，即肽指紋譜。用實(shí)驗(yàn)測(cè)得得蛋白質(zhì)酶解肽段質(zhì)量數(shù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，尋找具有相似肽指紋譜的蛋白質(zhì)。104.肽鏈降解成肽段：化學(xué)法和酶法（1）化學(xué)法溴化氰(cyanogenbromide,

NCBr)能特異地?cái)嗔央逆溨屑琢虬彼釟埢然鶄?cè)肽鍵。反應(yīng)在酸性溶液中幾乎可斷裂肽鏈中所有的上述肽鍵，產(chǎn)生一組肽段。105.（2）酶法1.胰蛋白酶：水解堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）羧基側(cè)的肽鍵。在操作中進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，可控制胰蛋白酶的水解位點(diǎn)。如用順丁稀二酸酐可保護(hù)賴氨酸殘基的ε－氨基，使胰蛋白酶只能水解精氨酸羧基側(cè)肽鍵；用1,2-環(huán)已二酮修飾精氨酸胍基使胰蛋白酶只水解賴氨酸羧基側(cè)肽鍵；106.2.V8蛋白酶來自金黃色葡萄球菌，水解肽鏈中酸性氨基酸（Glu和Asp）羧基側(cè)肽鍵，在pH4.0的乙酸緩沖液中只水解Asp羧基側(cè)肽鍵。3.胰凝乳蛋白酶，水解芳香族氨基酸的羧基側(cè)肽鍵。107.PMF基本路線雙向電泳蛋白酶酶切肽混合物質(zhì)譜分析的PMF數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定108.2DE膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的PMF109.測(cè)定肽化合物質(zhì)量數(shù)最有效的質(zhì)譜儀是MALDI-TOF-MS,靈敏度高，譜峰簡(jiǎn)單，每個(gè)譜峰代表一種肽段。PMF可同時(shí)處理許多樣品，是大規(guī)模鑒定的首選方法。用PMF方法成功鑒定的關(guān)鍵是所測(cè)得肽質(zhì)量數(shù)要有足夠的準(zhǔn)確度，3000Da以下的質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度至少要高于千分之0.5，鑒定蛋白成功率約50%-70%。還有一部分蛋白要結(jié)合序列信息即應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。110.2.肽序列標(biāo)簽串聯(lián)質(zhì)譜鑒定技術(shù)

(PeptideSequenceTag,PST)幾個(gè)殘基的多肽可以代表一個(gè)蛋白質(zhì)？20n204=160000APSTisdefinedasashortpeptidesequence(5to6aminoacids)flankedbytwomassescorrespondingtothetwoadjacentpolypeptides.

111.串聯(lián)質(zhì)譜儀可以直接測(cè)定肽段的序列肽段在質(zhì)譜儀的碰撞室解離貨源后衰變，肽鏈骨架斷裂并形成肽離子碎片，通過相鄰序列粒子的質(zhì)量差，可推算出氨基酸的片列順序，稱為肽序列標(biāo)簽技術(shù)（PST）112.b型和y型離子多見113.肽段在質(zhì)譜儀中用高速電子轟擊后可形成離子及斷裂成各種不同大小的帶電碎片，而且其斷裂點(diǎn)主要在肽鍵處。各碎片可被分離并測(cè)定其質(zhì)荷比，推導(dǎo)出質(zhì)量。組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸除亮氨酸和異亮氨酸外，質(zhì)量各不相同，因而能根據(jù)碎片的質(zhì)量推導(dǎo)出氨基酸序列。114.115.116.已知蛋白質(zhì)的MS/MS數(shù)據(jù)可用MS/MSfragmentionsearch117.用肽序列標(biāo)記搜索dbEST庫(kù)

CID譜和肽序列標(biāo)記從dbEST中搜索到的匹配序列118.三、翻譯后修飾蛋白質(zhì)的鑒定119.

翻譯后修飾

（Posttranslationaltranslation,PTM）在真核生物細(xì)胞，許多蛋白質(zhì)在翻譯中和翻譯后在氨基酸鏈上共價(jià)結(jié)合各種非肽類基團(tuán)，形成翻譯后修飾，修飾基團(tuán)約有20多種類型,常見的有磷酸化和糖基化修飾。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與其活性及功能狀態(tài)有關(guān)，也與蛋白質(zhì)所在細(xì)胞的種類和生命周期相關(guān)。120.PTM

●N-terminalorC-terminalmodificationRemovalofN-formylmethionineN-acetylation(50%ofeukaryoticproteins)●N-terminalandC-terminalprocessingMaturation,proteolyticprocessing●ModificationofindividualaminoacidsPhosphorylationGlycosylationMethylationUbiquitinationAcetylation……●Proteinsplicing:Intein121.（一）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定中的應(yīng)用由于翻譯后修飾引起蛋白質(zhì)質(zhì)量數(shù)的變化，而質(zhì)譜又是以質(zhì)量數(shù)為目標(biāo)的分析方法。如phosphorylation:79.9799;glycosylation80.0642鑒定策略一般是：先對(duì)其進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜（PMF）鑒定，然后對(duì)PMF中與理論值不符的肽段進(jìn)行翻譯后修飾預(yù)測(cè)，最后用串聯(lián)質(zhì)譜分析這些肽段序列（PST），進(jìn)行驗(yàn)證。122.對(duì)肽段的翻譯后修飾預(yù)測(cè)可以借助計(jì)算軟件進(jìn)行。FindMod程序http:///tools/findmod由澳大利亞Macquarie大學(xué)蛋白質(zhì)組分析實(shí)驗(yàn)室與瑞士生物信息研究所聯(lián)合開發(fā)使用者只要輸入蛋白質(zhì)的PMF數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果，F(xiàn)indMod程序自動(dòng)尋找那些在檢索時(shí)沒有匹配的質(zhì)量數(shù)，并列出可能產(chǎn)生這些質(zhì)量數(shù)的修飾肽段的序列和修飾方式。123.（二）磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定磷酸化一般發(fā)生在帶有-OH的殘基側(cè)鏈上，如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的羥基。鑒定的步驟：①確定磷酸肽

先用蛋白酶將磷酸化蛋白質(zhì)降解，再用磷酸酶處理肽片段，分析去磷酸化前后PMF的差異，尋找質(zhì)量數(shù)減少80或80倍數(shù)的肽段，確定肽段是否發(fā)生磷酸化及磷酸化的數(shù)目。124.②確定磷酸化位點(diǎn)用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)磷酸肽進(jìn)行序列分析。磷酸肽在CID碰撞室解離或經(jīng)源后衰變(PSD)裂解為碎片離子，含磷酸基團(tuán)的肽段同時(shí)會(huì)產(chǎn)生丟失80和98質(zhì)量數(shù)的碎片峰，分別是[M+H-HPO3]＋和[M+H-H3PO4]＋峰。同時(shí)，磷酸肽也會(huì)產(chǎn)生丟失80和98質(zhì)量數(shù)的y、b等系列離子峰，通過序列分析可以確定磷酸基團(tuán)連接的位點(diǎn)。125.許多重要的調(diào)控蛋白是糖蛋白（生長(zhǎng)因子）126.（三）糖基化蛋白質(zhì)的鑒定糖基化修飾:蛋白鏈上的蘇氨酸、絲氨酸殘基的羥基與N-乙酰氨基葡萄糖(GalNAc)的異頭碳形成O-糖苷鍵；天冬氨酸殘基的氨基與N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的異頭碳形成N-糖苷鍵。127.GlycoproteinsN-glycosidiclinkageCH2-CO-NH-GlcNAc-GlcNAc-….O-glycosidiclinkageCH2-O-GalNAc-….peptidebackbonepeptidebackbone128.對(duì)糖蛋白的分析包括：序列分析、糖鏈中的單糖組成、糖基化位點(diǎn)、糖鏈中單糖排列順序、以及單糖的差向異構(gòu)。方法：酶解成肽段，糖苷內(nèi)切酶處理，對(duì)比處理前后肽段質(zhì)量數(shù)的改變，PMF分析找到糖肽段，再對(duì)其進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析確定糖基化位點(diǎn)。糖鏈連接順序分析，用不同的糖苷外切酶，從糖鏈外測(cè)逐個(gè)切除單糖殘基，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定糖鏈結(jié)構(gòu)。129.四、生物信息學(xué)（Bioinformatics）130.生物信息學(xué)定義它是生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。它通過對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析，進(jìn)而達(dá)到揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。131.BioinformaticsandGenomics/ProteomicsSequence,OtherDataPathwaysandRegulatoryCircuitsHypotheticalCellUnknownGenesPutativeFunctionalGroups132.（一）蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)在網(wǎng)上可以查詢到最新的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。常用的如NCBI: SWISS-PROT:http://www.expasy.ch/NCBI上的數(shù)據(jù)庫(kù)中，信息最豐富的是Genpept格式，包括有蛋白的序列，各種性質(zhì)，甚至于參考文獻(xiàn)。133.Genpept示例134.Genpept示例135.FASTA格式FASTA格式就是蛋白的氨基酸序列。136.

數(shù)據(jù)庫(kù)說明WWW地址蛋白質(zhì)序列庫(kù):SWISS-PROT內(nèi)容豐富,提示詳盡http://www.expasy.ch/sport/PIR較/pir/pir-psi.htmlTrEMBL(EMBL的翻譯)http://www.expasy.ch/sprotOWL(非冗余庫(kù))http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù):EMBL歐州分子生物學(xué)http://www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美國(guó)生物工程信息中心/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列標(biāo)記/dbEST/137.模體與域:PROSITE序列模體http://www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS保守序列http://www./ProDom蛋白質(zhì)域http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白質(zhì)域http://base.icgeb.trieste.it/sbase/二維電泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE國(guó)際2DPAGE庫(kù)的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的連絡(luò)表/links.htm2DWG二維電泳圖譜元庫(kù)/2dwgDB/Flicker成對(duì)電泳圖譜比較/flicker/三維結(jié)構(gòu)庫(kù):PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)庫(kù)/SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.htmlSWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http://www.expasy.ch/sw3d/DSSP二級(jí)結(jié)構(gòu)命名ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dsspFSSP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/138.翻譯后修飾:O-GLYCBASE糖基化http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/PHOSPHOBASE磷酸化http://www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/deltamass翻譯后修飾匯編.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html基因組庫(kù):dblist基因組庫(kù)目列http://www.expasy.ch/amos-www-links.html#organismsGDB基因組庫(kù)/OMIM遺傳病表型/omim/GeneCards生物醫(yī)學(xué)知識(shí)http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/139.代謝庫(kù):Boehringer圖代謝路徑圖http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-indexENZYME酶及其反應(yīng)的命名http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.htmlEcolyc大腸桿菌中間代謝/ecocyc/ecocyc.htmlHinCys嗜血流感中間代謝/ecocyc/hincyc.htmlWIT酶和代謝途徑/WIT/相互作用:GIF-DB果蠅發(fā)育中的基因相互作用http://gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home.htmlKEGG基因相互作用http://www.genome.ad.jp/keggDeletion酵母功能基因組/group/yeast-deletion-project/deletion.html

140.（二）用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件PeptIdent/tools/peptident.htmlMascot/search_form_select.htmlProteinProspector/MOWSEhttp://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowsePeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/GroupPages/PageLink/peptidesearchpage.htmlAACompSim/AACompIdenthttp://www.expasy.ch/tools141.蛋白質(zhì)組SCI雜志MCP:Molecular&CellularProteomics9.6JPR:JournalofProteomeresearch5.1Proteome:4.5142.第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀及應(yīng)用143.

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究致病微生物的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

144.

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物。瑞士的一個(gè)小組通過2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在ｐＨ3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠分離了很難分離到的5-20kd范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種。另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在ｐＨ6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白。華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了263個(gè)蛋白質(zhì),其中大部分是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì)。另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過了翻譯后加工.145.大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的ＤＮＡ序列已被測(cè)定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來,就會(huì)得到更多有用的信息。基于此想法,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),希望籍此來回答以下幾方面的問題:ａ所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置；ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度；ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化；ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位；ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平。146.

目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物)；對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Ｇenbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度)。147.致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上。當(dāng)今,細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗性,尋找作用于細(xì)菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開,找到了許多有效的抗菌化合物。但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機(jī)理。例如在研究抑制核糖體類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí),對(duì)12種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察,發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì),另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì),因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng),并且籍此可以推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上。148.

蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢(shì)在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化。例如作為一種差異顯示技術(shù),這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差別,這可能部分解釋近年來牛痘作為結(jié)核病疫苗會(huì)出現(xiàn)失敗的現(xiàn)象。149.釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作。最新版的數(shù)據(jù)庫(kù)包括6000多頁(yè),每頁(yè)代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白.它包含以下幾方面的信息:ａ以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等;ｂ一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類方面的信息;ｃ從以往的超過5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.150.

正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜。初步的研究表明,缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì),而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變。一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多,當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變。單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化。大約20%的酵母基因缺失是致死性的,另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化。這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話”和“作用”的重要信息,如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)、信號(hào)傳遞途徑,以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。151.

多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究

線蟲的蛋白質(zhì)組研究果蠅的蛋白質(zhì)組研究植物的蛋白質(zhì)組研究人類的蛋白質(zhì)組研究152.果蠅的蛋白質(zhì)組研究

不同性別果蠅(Drosophilamelanogaster)成蟲的頭、胸、腹部的蛋白質(zhì)組圖譜已被分別作出,總共約有1200個(gè)蛋白質(zhì)被檢出,其中的大多數(shù)在頭、胸、腹中是相同的,但也發(fā)現(xiàn)了一部分其部位、性別特異的蛋白質(zhì)。153.

人類的蛋白質(zhì)組研究

人類的蛋白質(zhì)組研究吸引了最多的注意力。由于人有著大量的組織、細(xì)胞類型和發(fā)育階段,對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上。已有的證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的。因此對(duì)于人類來說,一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜。人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究。154.

人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)都被用于研究與某些疾病的關(guān)系。最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段。在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。155.

腫瘤至今仍是人類的一個(gè)頑敵。癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來源的腫瘤細(xì)胞的來源。丹麥的一個(gè)小組利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)結(jié)合組織冰凍切片技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織,發(fā)現(xiàn)在所有的鱗狀細(xì)胞瘤的尿液中均能發(fā)現(xiàn)一種化學(xué)引誘劑—銀屑素(psoriasin),推測(cè)其極可能作為這種腫瘤的早期標(biāo)志物。156.國(guó)外研究現(xiàn)狀：蛋白質(zhì)組研究的第一篇原始論著于1995年發(fā)表在Electrophoresis雜志上1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)國(guó)家蛋白質(zhì)組研究中心。同年丹麥、加拿大也先后成立了國(guó)家蛋白質(zhì)組研究中心，隨后美國(guó)、丹麥、瑞士瑞典、英國(guó)、法國(guó)、意大利、日本和德國(guó)等也加入了蛋白質(zhì)組研究行列。157.2001年國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO）成立，同時(shí)提出了人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HPP),并相繼啟動(dòng)了人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HPPP)、人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HLPP），人類腦蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HBPP)，以及蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃（PSI)等幾個(gè)重大國(guó)際合作項(xiàng)目158.

血漿具有多種重要的生理功能，人體器官的病理變化可導(dǎo)致血漿蛋白在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變，這種特征性的變化對(duì)疾病診斷和療效監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。然而，迄今為止人類對(duì)血漿蛋白的了解還十分有限，只有很少一部分血漿蛋白被用于常規(guī)的臨床診斷。全面而系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)健康和疾病狀態(tài)下血液循環(huán)中血漿蛋白的組成，將極大地加速用于疾病診斷和治療監(jiān)測(cè)的血漿標(biāo)志蛋白的研發(fā)。

HUPO于2001年首先選擇了HPPP作為人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃首期執(zhí)行計(jì)劃之一，其初期目標(biāo)是：a.比較各種蛋白質(zhì)組分析技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)和局限性；b.用這些技術(shù)平臺(tái)分析人類血漿和血清的參考樣本；c.建立人類血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HPPP)159.

肝臟是人體內(nèi)的一種具有多種重要功能的器官，是物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換及供應(yīng)的“樞紐”。同時(shí)，肝臟疾病是一類常見病，多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，全世界10%以上的人口患有肝臟疾病。HUPO于2002年建議啟動(dòng)人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HLPP）。

HLPP科學(xué)目標(biāo)是：通過對(duì)肝臟蛋白質(zhì)全景式、高通量和規(guī)?；难芯浚馕龈闻K蛋白質(zhì)在生理、病理過程中的功能意義，揭示人類肝臟的生理功能和重大肝臟疾病的發(fā)病機(jī)理，為肝臟疾病的預(yù)防、診斷和治療，以及創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)。人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃(HLPP)160.企業(yè)與制藥公司紛紛斥巨資開展蛋白質(zhì)組研究參與完成人類基因組測(cè)序的Celera公司投資上億美元啟動(dòng)了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作，為藥物的開發(fā)選擇靶分子日內(nèi)瓦蛋白質(zhì)組公司與布魯克質(zhì)譜儀制造公司聯(lián)合成立了世界上最大的蛋白質(zhì)組研究中心。美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)161.國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院與湖南師范大學(xué)已啟動(dòng)蛋白質(zhì)組研究中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院與復(fù)旦大學(xué)相繼成立了專門的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。在“重大疾病的功能蛋白質(zhì)組學(xué)”方面取得了良好的起步，我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展162.針對(duì)有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的生物體或組織/細(xì)胞，建立其蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組（或蛋白質(zhì)表達(dá)譜）及其蛋白質(zhì)組連鎖群，即compositionalproteomics研究以重要生命過程或人類重大疾病為對(duì)象，進(jìn)行重要生理/病理體系或過程的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即comparativeproteomics研究。選擇l一2類重大生命活動(dòng)或重大疾病中幾個(gè)相繼的重要階段，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)作圖，進(jìn)行系統(tǒng)的定性和定量比較，進(jìn)而對(duì)差別蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，蛋白質(zhì)組學(xué)的前沿研究方向：163.蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺(tái)和生物信息學(xué)的研究支撐技術(shù)平臺(tái)包括：新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)的方法及程序；高通量系統(tǒng)及蛋白質(zhì)組分析自動(dòng)操作系統(tǒng)；蛋白質(zhì)分析鑒定中新型質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用；大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)。生物信息學(xué)包括：蛋白質(zhì)組成員的序列、結(jié)果、功能及定位分類；基于生化途徑、遺傳網(wǎng)絡(luò)等，構(gòu)建蛋白質(zhì)組功能系統(tǒng)即蛋白連鎖圖；建立人或其他動(dòng)物的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)；高等生物基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的識(shí)別及算法研究；基因翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)；基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)與知識(shí)庫(kù)的知識(shí)與規(guī)律發(fā)現(xiàn)。164.

基因組計(jì)劃無疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來一場(chǎng)革命,但也應(yīng)該看到,單純的遺傳分析很難診斷多因素的疾病。復(fù)雜的基因間相互作用,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和環(huán)境的影響都會(huì)影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的翻譯后加工。因此,可靠的診斷和治療應(yīng)基于機(jī)體漸進(jìn)發(fā)展過程的調(diào)控及失調(diào),并且必須考慮到環(huán)境因素的影響。蛋白質(zhì)組的研究正是探索這一領(lǐng)域的有力武器。

165.

人們不難預(yù)期,基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫(kù);生物信息學(xué)的發(fā)展會(huì)給蛋白質(zhì)組計(jì)劃提供更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件;國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)會(huì)使各國(guó)各領(lǐng)域科學(xué)家有關(guān)蛋白質(zhì)組研究的成果出現(xiàn)新的集成;新的技術(shù)會(huì)不斷涌現(xiàn),蛋白質(zhì)組研究方法會(huì)象PCR技術(shù)一樣易于操作,并滲透到人類活動(dòng)的方方面面,對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生各行各業(yè)帶來新的革命。166.思考題1.蛋白質(zhì)組研究的內(nèi)容及意義2.雙向凝膠電泳的原理和應(yīng)用167.感謝各位168.

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究致病微生物的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

169.

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物。瑞士的一個(gè)小組通過2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在ｐＨ3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠分離了很難分離到的5-20kd范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種。另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在ｐＨ6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白。華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了263個(gè)蛋白質(zhì),其中大部分是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì)。另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過了翻譯后加工.170.大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的ＤＮＡ序列已被測(cè)定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來,就會(huì)得到更多有用的信息?；诖讼敕?建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),希望籍此來回答以下幾方面的問題:ａ所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置；ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度；ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化；ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位；ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平。171.

目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物)；對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Ｇenbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度)。172.致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上。當(dāng)今,細(xì)菌對(duì)大