DB15T+2835-2022馬駑巴貝斯蟲檢測 PCR法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T2835—2022PCRPCRmethodfordetectionofbabesiosiscaballi2022-12-082022-12-082023-01-08內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國二連海關(guān)、內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理評審查驗(yàn)中心。本文件主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、常鴻、包勇敢、荊文魁、騰克、趙治國。馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法范圍本文件規(guī)定了馬駑巴貝斯蟲PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。本文件適用于馬屬動(dòng)物馬駑巴貝斯蟲病的分子生物學(xué)診斷。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。馬駑巴貝斯蟲babesiosiscaballi聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCRDNA（deoxyribonucleicacidDNA經(jīng)過DNADNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribonucleoside）DNA25～30106。實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過程。Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR:（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]GB/T6682DNACTAB。。。K20。。K20mg/mL)TaqdNTP（2.5mmol/L）PCRbuffer。DNA（DNAMarker）（50bp～500bp）PCRDNAB。DNA。。表1馬駑巴貝斯蟲檢測引物及探針檢測方法引物/探針序列（5’-3’）擴(kuò)增片段PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′實(shí)時(shí)熒光PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′探針（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′PCR（12000rpm）（12000rpm）（3000rpm）天平0.01g）。單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7樣品采集使用添加EDTA抗凝劑的采樣管無菌采集血樣。8檢測方法PCR法DNAADNADNA，DNADNAA260/A2801.7～1.9PCRPCR反應(yīng)體系為50L，體系組成見表2。表2PCR試劑名稱貯備液濃度反應(yīng)體系體積L10×Buffer(含Mg2+)－5Taq酶5U/L0.25dNTP2.5mmol/L5上游引物（F）10mol/L2下游引物（R）10mol/L2模板－2ddH2O－補(bǔ)足至50檢測過程分別設(shè)陰性對照、陽性對照和空白提取對照。PCR預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。PCR用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5L～8LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合點(diǎn)樣。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并記錄。質(zhì)控對照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：200bp200bp200bp200bp200bpPCRPCR實(shí)時(shí)熒光PCR檢測DNA同7.1.1操作。PCR反應(yīng)體系體積為25L，見表3。表3熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積LPCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5上游引物（F）101下游引物（R）101探針（P）101模板—2ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25檢測過程分別設(shè)陰性對照、陽性對照和空白提取對照。預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40個(gè)循環(huán)。在58℃時(shí)收集熒光信號值。質(zhì)控對照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：Ct40.0；Ct40.0；Ct35.0。，2Ct40.0，2Ct35.01Ct35.0～40.0DNAPCRCtCt40.09防止交叉污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。附錄A（資料性）溶液配制及提取方法CTAB將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。DNA4000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～6504000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC附錄B（規(guī)范性）馬駑巴貝斯蟲的目標(biāo)擴(kuò)增序列CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCTTGAGGCTAAGTACCA