血紅蛋白電泳及其臨床應(yīng)用

文獻(xiàn)管理序列號：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]文獻(xiàn)管理序列號：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]血紅蛋白電泳及其臨床應(yīng)用血紅蛋白電泳及其臨床應(yīng)用鄢盛愷中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院檢查科，北京100730早在60數(shù)年前Pauling等（1949）在研究鐮狀紅細(xì)胞貧血患者的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）時(shí)就發(fā)現(xiàn)其與正常人不同，證明這種異常的Hb在缺氧條件下是產(chǎn)生紅細(xì)胞鐮變和溶血性貧血的因素，并提出了“分子病”這一新概念。引發(fā)了人們對Hb構(gòu)造異常及異常Hb與遺傳性貧血之間關(guān)系的重視。近年來，由于生化技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不停發(fā)展，相繼發(fā)現(xiàn)和鑒定了許多新型異常的Hb。電泳技術(shù)作為分離與鑒定Hb最簡便、精確的辦法之一，廣泛用于臨床遺傳性貧血（如地中海貧血）、異常血紅蛋白病等疾病的臨床診治。1概述Hb的重要生理功效是將氧氣從肺部運(yùn)輸?shù)浇M織，同時(shí)將組織釋放的二氧化碳帶回到肺部完畢氧氣和二氧化碳的交換。Hb是由珠蛋白和亞鐵血紅素連接成的一種結(jié)合蛋白質(zhì)。每一種Hb是由4個(gè)多肽鏈構(gòu)成，而每一肽鏈又和一種鐵卟啉結(jié)合。和血紅素連接的珠蛋白是一種組蛋白，每一種珠蛋白分子由4條肽鏈構(gòu)成，每一條肽鏈和一種血紅素結(jié)合，構(gòu)成一種Hb單體或稱為亞單位。因此，每個(gè)Hb分子是由4個(gè)Hb單體聚合而成的四聚體?，F(xiàn)在已知人類的紅細(xì)胞中存在3種正常的Hb，即HbA、HbA2和HbF。從正常Hb中已發(fā)現(xiàn)α、β鏈、γ和δ4種不同肽鏈。這些Hb由均由一對α鏈和一對非α鏈構(gòu)成。正常成人Hb的非α鏈稱為β鏈，而胎兒Hb中的非α鏈稱為γ鏈。HbA含量最多，它由兩條α鏈和兩條β鏈構(gòu)成；HbA2（占3%）由兩條α鏈和兩條δ鏈構(gòu)成。HbF正常含量是Hb的2%，由兩條α鏈和兩條γ鏈構(gòu)成。除HbA、HbA2和HbF外其它的多個(gè)Hb常被稱為異常Hb。全世界現(xiàn)在已報(bào)道的異常Hb達(dá)450余種，并且每年尚有新的發(fā)現(xiàn)。如美國最常見的兩種Hb變異體是HbS和HbC，而HbLepore，HbE，HbA2G-philadelphia等幾類極少見?，F(xiàn)已證明這些異常Hb的不同之處不在于亞鐵血紅素部分，而在于珠蛋白部分化學(xué)構(gòu)造的差別。重要類型有：⑴肽鏈中氨基酸的次序略有差別。這類型最為多見，約占90%。如HbS（HbA→HbS是由于α2β2→α2β2S），HbC（HbA→HbC是由于α2β2→α2β2C）；⑵各肽鏈的重新組合或某些正常肽鏈的缺失。如HbH（HbA→HbH是由于α2β2→β4），HbBart’s（HbA→HbBart’s是由于α2γ2→γ4）；⑶Hb肽鏈的融合。如HbLepore是δ鏈的二分之一（N端）與β鏈的一端（C端）融合而成；⑷肽鏈中氨基酸增多，可在中間嵌入或在C端延長。等。以前發(fā)現(xiàn)的Hb皆以英文字母命名，由A~Q（B除外，加上S）。隨著新發(fā)現(xiàn)的Hb越來越多，字母不夠用，現(xiàn)規(guī)定從Q后來的字母不能再用以命名，而以發(fā)現(xiàn)地或?qū)嶒?yàn)室命名。臨床實(shí)驗(yàn)室慣用的分離和鑒定Hb的辦法有醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、柱層析和某些有關(guān)的化學(xué)實(shí)驗(yàn)。地中海貧血是一種常染色體顯性遺傳病，是我國南方最常見和危害最大的遺傳病之一。應(yīng)用電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量對于貧血類型的臨床診療及治療含有重大意義。全自動電泳分析系統(tǒng)的引進(jìn)將為臨床診療地中海貧血及異常Hb病提供精確的實(shí)驗(yàn)室辦法和根據(jù)。近年來分子生物學(xué)技術(shù)已用于因異常Hb引發(fā)的遺傳性疾病的基因診療中。I-12Hb電泳2.1原理Hb的分離和鑒定辦法諸多，其中以電泳法最為慣用且最為重要，諸多異常Hb都是首先用電泳法發(fā)現(xiàn)的。其原理是Hb中的珠蛋白和其它蛋白質(zhì)同樣為兩性電解質(zhì)，在不同的緩沖液中可帶正或負(fù)電荷，在電場中向陰極或陽極移動。由于不同的蛋白質(zhì)之間（正常Hb與異常Hb）其等電點(diǎn)、分子大小、形狀及所帶電荷的不同，其移動速率不同（電泳遷移率不同），在一定的支持介質(zhì)中可借以分離。不同的電泳辦法含有不同的電場強(qiáng)度、pH、緩沖液或支持物。2.2慣用辦法最慣用的辦法是堿性緩沖液電泳。早期用醋纖膜作為支持介質(zhì)，在堿性環(huán)境下（pH8.4~8.6）可快速分離HbA、HbA2和HbF及其它多個(gè)變異體?？墒遣荒軐bS與HbD和HbG分開，由于后3種Hb在這一電泳系統(tǒng)中含有相似的遷移率。同樣，在堿性條件下，HbC、HbE、HbO與HbA2也有相似的遷移率。1976年美國疾病防止與控制中心（CDC）和美國臨床實(shí)驗(yàn)室原則化委員會（NCCLS）曾推薦用醋酸纖維素薄膜電泳（Helena實(shí)驗(yàn)室的辦法與之基本相似）作為異常Hb檢測的初級實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)多用分辨率更高的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。而酸性緩沖液（pH6.0~6.2）電泳可用來分離那些在堿性緩沖液電泳中不能分離開的Hb，如HbS及HbC。在此酸性條件下，HbD、HbO（或HbE）與HbS及HbC可明顯的分開。電泳后Hb可用麗春紅S、酸藍(lán)或氨基黑10B進(jìn)行染色，將電泳區(qū)帶與已知的對照比較，并用光密度計(jì)進(jìn)行掃描定量。對于某些特殊的Hb如HbS、HbA2、HbF和不穩(wěn)定Hb（如HbM、HbH、HbE等）可分別采用溶解度實(shí)驗(yàn)、柱層析法、堿變性法（Singer法）及不穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)（異丙醇實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行鑒定。珠蛋白鏈電泳、等電聚焦和氨基酸序列分析可用來證明稀有的Hb存在，多用于研究?，F(xiàn)在已有多個(gè)自動化電泳分析儀可應(yīng)用于臨床常規(guī)Hb電泳，如Helena公司的REP、SPIEF等型號，Sieba公司的HYDRASYS。其中堿性緩沖液電泳為慣用篩選辦法。2.3電泳成果2.3.1堿性緩沖液電泳在堿性緩沖液中全部Hb均向陽極移動，其移動次序?yàn)椋篐bH>HbA3>HbA1>HbF>HbS/HbD/HbG>HbC，HbA2/HbC/HbE/HbO>CA1>CA2（CA1為碳酸酐酶1，CA2碳酸酐酶2）。正常人可見4條區(qū)帶：HbA>HbA2>CA1>CA2（若用聯(lián)苯胺染色，CA1與CA2則不顯色）。在點(diǎn)樣處有一條蛋白帶，它是非Hb成分，為細(xì)胞基質(zhì)和膜蛋白。2.3.2酸性緩沖液電泳在酸性緩沖液中，HbA、HbD、HbE和HbG向陰極移動，而HbF比它們更靠近陰極。HbC向陽極移動得最快，HbS也向陽極移動，但比較靠近點(diǎn)樣點(diǎn)。2..3.3成果報(bào)告有兩種報(bào)告方式：⑴定性：將染色后的電泳膠片用質(zhì)控膠片對比即可判斷膠片有無Hb。⑵定量：染色后的電泳膠片用光密度計(jì)掃描，報(bào)告各條帶的比例值。各區(qū)帶參考值，根據(jù)不同年紀(jì)有不同的范疇。例：正常成人：Hb（A+F）94.5%~98.5%HbA22.5%~3.5%新生兒(1個(gè)月)：HbA12%~40%HbF6%~93%HbA20.1%~1.0%嬰兒（3個(gè)月）：HbA1.00%—65.00%HbF34.3%—82.95%HbA20.04—2%嬰兒(6個(gè)月)：HbA86%~98%HbF0.84%~10.7%HbA20.87%~2.9%I-23臨床意義足月的初生嬰兒血液中的約70%~80%的Hb為HbF，同時(shí)也存在少量的HbA和HbA2。很快HbF濃度快速下降，同時(shí)HbA對應(yīng)增加，絕大多數(shù)于出生后6個(gè)月至2年后，HbF降至成人的正常水平。HbA2增高是β輕型地中海貧血的一種重要特性。HbA2減低見于缺鐵性貧血及其它Hb合成障礙性疾病（常見如α地中海貧血）。電泳發(fā)現(xiàn)異常Hb如HbH、HbBart’s、HbC-S、HbK等則可確診為對應(yīng)的Hb分子病。據(jù)廣東省人民醫(yī)院資料統(tǒng)計(jì)，該院一年所做Hb電泳5800人次（全部產(chǎn)前檢查及貧血待查病人），共檢出地中海貧血和異常Hb病患者1375人，陽性率23.7%。其中（1）α地中海貧血基因攜帶者（HbH病患者、PCR確診α-地中海貧血、新生兒HbBart’s區(qū)帶者）1018人，陽性率17.6%。（2）β-地中海貧血基因攜帶者327人，陽性率5.6%。(3)異常HbJ、HbK、HbN、HbG、HbD和HbE共30人占總?cè)藬?shù)0.52%。3.1α-地中海貧血是由于珠蛋白基因缺失或突變，造成α珠蛋白肽鏈合成障礙所致。我國多數(shù)是α珠蛋白基因缺失。3.1.1靜止型α-地中海貧血無臨床癥狀、體征、無貧血，紅細(xì)胞形態(tài)正常。HbA2和HbF正常，新生兒期可出現(xiàn)1%~3%HbBart’s，出生后3個(gè)月消失。父母任一方有α-地中海貧血。3.1.2原則型輕型患者無癥狀。呈輕型小細(xì)胞低色素性貧血。有輕度紅細(xì)胞形態(tài)變化。HbA2含量為正常低限（1.5%~2.5%），β/α約1.4/1，HbF正常。新生兒期HbBart可達(dá)5%~8%，6個(gè)月完全消失。父母任一方有α-地中海貧血。3.1.3HbH病臨床體現(xiàn)有輕、中度貧血，2/3以上病例有肝脾腫大，常重復(fù)出現(xiàn)黃疸。在妊娠、感染及使用氧化劑時(shí)，Hb顯著下降。父母雙方常有α-地中海貧血。實(shí)驗(yàn)室檢查：有溶血性貧血的特性，骨髓中紅細(xì)胞系統(tǒng)增生極度活躍。HbH明顯增高（2.5％~40％），HbA2及HbF含量正常。Hb電泳可出現(xiàn)HbH區(qū)帶。紅細(xì)胞滲入脆性實(shí)驗(yàn)減少，紅細(xì)胞包涵體陽性。3.1.4HbBart’s胎兒水腫綜合征臨床體現(xiàn)：該病為α-地中海貧血中最嚴(yán)重者，胎兒常于妊娠后期死亡或早產(chǎn)。胎兒生下時(shí)，全身水腫，皮膚蒼白，黃疸，肝脾腫大，常于產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。父母雙方都有HbH病或原則型α-地中海貧血。實(shí)驗(yàn)室檢查：有溶血性貧血的特性，骨髓紅系增生活躍。紅細(xì)胞形態(tài)靶形紅細(xì)胞明顯增多，外周血可見有核紅細(xì)胞。Hb電泳：HbBart成分>80％，抗堿Hb增加，出現(xiàn)少量HbPortland或少量HbH。3.2β-地中海貧血是由于β珠蛋白鏈合成減少或完全不能合成所致。完全不能合成β珠蛋白鏈的地貧基因稱為β0，合成減少的稱為β+。3.2.1重型臨床體現(xiàn)：又稱庫利氏貧血（Cooleyanlsnua）患者癥狀嚴(yán)重，多在小朋友期夭折。少數(shù)癥狀較輕，可活至成年，此型又常稱為中間型。庫利氏貧血在嬰兒期6~9個(gè)月開始出現(xiàn)貧血，黃疸、肝脾腫大。小朋友患者發(fā)育不良、智力遲鈍、骨骼變化如顴骨隆起，眼距增寬，鼻梁低平。Ｘ線可見外板骨小梁條紋清晰呈直立的毛發(fā)樣等。多在幼兒時(shí)死于重度貧血或感染。若能生長超出10歲，可出現(xiàn)個(gè)體矮小，性功效、甲狀腺及甲狀旁腺等功效低下，可繼發(fā)血色病，出現(xiàn)心律系亂、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。父母常都有輕型?-地中海貧血。實(shí)驗(yàn)室檢查：Hb<60g/L，呈小細(xì)胞低色素性貧血，靶形細(xì)胞多見，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多；骨髓紅系統(tǒng)輕度增生。Hb電泳：HbF>30％。I-33.2.2輕型臨床體現(xiàn)：無癥狀或有輕度分血癥狀，肝脾無腫大或輕度腫大。父母一方為β-地中海貧血雜合子。實(shí)驗(yàn)室檢查：Hb稍減少或正常，外周血少量靶形細(xì)細(xì)胞。HbA1>3.5％，HbF輕度增加（不超出5％）。I-33.2.3中間型臨床體現(xiàn)：癥狀和體征介于重型和輕型?-地中海貧血之間。實(shí)驗(yàn)室檢查：同重型?-地中海貧血。遺傳學(xué)：父或母均為?-地中海貧血雜合子狀態(tài)。根據(jù)臨床體現(xiàn)，小細(xì)胞低色素性貧血，Hb電泳及HbF、HbA2含量測定有家族史，普通不難作出診療。3.3異常Hb病異常Hb病指因正常成人HbA的產(chǎn)生受到部分或完全的克制，被另一種或幾個(gè)異常的Hb部分或完全取代而產(chǎn)生的病癥，例如HbS和HbC等常與溶血性貧血、鐮狀紅細(xì)胞或靶形紅細(xì)胞等特性聯(lián)系在一起。事實(shí)上，某些異常Hb的存在，并不引發(fā)生理上的任何特性，也并不是全部異常Hb攜帶者都有特殊的臨床體現(xiàn)。有些異常Hb攜帶者，能夠終身健康地生活，僅在居民普查或因其它疾病就醫(yī)時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。固然，這些Hb變異體仍有其生物化學(xué)、遺傳學(xué)及人類學(xué)意義。那些有臨床意義的異常Hb，涉及到防止，治療等一系列問題。早期發(fā)現(xiàn)的某些Hb變異體，如HbＳ、Ｃ、Ｄ、Ｅ等，多出現(xiàn)在溶血性貧血患者身上?，F(xiàn)在看來，有某