信號肽對外源蛋白分泌效率的影響

信號肽對外源蛋白分泌效率的影響

即使是真實的核或原核細胞，分泌性蛋白質(zhì)也必須在合成后離開細胞和積累。一般而言,決定蛋白質(zhì)命運的是蛋白N端一段額外氨基酸序列,即信號肽或信號序列(signalpeptideorsignalsequence)。初生蛋白正確定位后,信號肽被信號肽酶水解,初生蛋白釋放,經(jīng)過折疊等立體構(gòu)象的變化,轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓牡鞍踪|(zhì)。本文對信號肽研究的現(xiàn)狀和進展進行綜述。外源蛋白的純化需要該蛋白自細胞中高效地分泌,目前研究認為,該過程最重要因素之一,是選擇適宜的信號肽序列。目前研究采用外源蛋白自身信號序列或外源信號序列,或兩者兼而有之。一般信號肽具有以下特征:1信號肽agt基因序列及eg基因的整合信號肽假說認為,蛋白質(zhì)之所以能跨膜送輸,主要是因為信號肽中存在的疏水結(jié)構(gòu)。有人研究酵母phoA信號肽疏水核心Leu:Ala比值時發(fā)現(xiàn),當Leu:Ala為6∶4時,前體蛋白分泌加工能力最高,在此比值附近,信號肽分泌加工能力隨疏水性增強而提高,此時,前體蛋白質(zhì)可以不依賴分子伴侶或其它輔助因子也能較好分泌。由此,可以推測將強疏水核心的信號肽序列在合適位點與外源基因融合后,可以促進重組蛋白分泌,獲得穩(wěn)定且便于純化的重組蛋白。合成了一段具有10個Leu強疏水核心的信號肽ASP(artificialsignalpeptide),在EcoRI_Kpn位點處與青霉素G?；?penillicinGacylasePAC)野生型信號肽(wildtypesignalpeptide,WTSP)序列融合。實驗結(jié)果表明,強疏水核心的信號肽ASP使平均83.5%PAC前體表達產(chǎn)物有效分泌至周質(zhì)空間,比野生型信號肽WTSP提高了約41%,可見PAC的高效分泌依賴于具有強疏水性的信號肽。2采用主枝細胞信息交換劑2.1外源基因表達信號肽沒有嚴格專一性,因而可利用宿主細胞自身信號序列分泌外源蛋白。如大鼠胰島素原如果接上原核細胞信號肽,就能通過E.coli的質(zhì)膜分泌到胞外。以E.coli分泌信號OmpA構(gòu)建一株高表達分泌型重組人生長激素(hGH)基因工程菌,其表達產(chǎn)物與天然hGH一致。以酵母為表達載體,高密度發(fā)酵可獲得足量人源性重組蛋白,且發(fā)酵產(chǎn)物沒有大腸桿菌中常見的內(nèi)毒素,在臨床治療方面有重要作用。一般而言,外源信號序列雖可以引導蛋白分泌,但效率較低。因此,在一定程度上,需要依賴酵母本身的分泌信號肽來指導外源基因表達產(chǎn)物的分泌。常用的酵母信號肽有存在于酸性磷酸脂酶(PHO5),蔗糖酶(SUC2)和α因子(MFα1),Killer毒素等中的內(nèi)源性信號肽,其中以α因子信號肽應用最廣。研究顯示,在α因子中間插入EEAEAEAEPK10個氨基酸,新的信號序列可提高胰島素在畢赤酵母中的分泌。2.2外源基因的切割α因子信號肽包含83個氨基酸的前導肽及后面一段由lys_Arg(Glu_Ala)1-2或Lys_Arg_Glu_AlaAsp_Ala氨基酸序列組成的間隔肽。膜結(jié)合蛋白酶KEX2基因產(chǎn)物識別lys_ArgC端,STE13基因產(chǎn)物則識別(Glu_Ala)1-2或Asp_Ala外側(cè)。前導肽和間隔肽對蛋白的正確切割和分泌至關(guān)重要,但有時由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同,會在外源蛋白的N端產(chǎn)生不同的切割位點,使一些分泌的蛋白N端帶有(Glu_Ala)1-2融合序列,即產(chǎn)生了所謂的酵母信號肽切割不完全現(xiàn)象。酵母細胞中α因子蛋白質(zhì)前體的成熟加工,就發(fā)生在α因子與啟動子基因編碼的第85個密碼子(精氨酸密碼子)處,在加工過程中,α因子的前導肽被切除,但釋放的α因子氨基末端仍帶有4個多余的氨基酸殘基,可能與酵母的二氨基肽酶的活力不足有關(guān)。如果適當改變酵母信號肽,可獲得與天然蛋白一致的氨基酸序列。吳瑞實驗室在構(gòu)建載體pYA_4時,預先除去前導肽編碼順序第85密碼子下游的4個密碼子,并在第85個密碼子處重建一個HindIII位點(便于與外源基因的編碼直接相連)。利用這種載體表達外源基因,分泌到介質(zhì)中的成熟蛋白不含多余的氨基酸殘基。畢赤酵母中克隆表達人三葉因子3(hTFF3),可在正向引物中加入α因子信號肽酶切序列,反向引物中刪去表達Glu_Ala的基因序列,從而表達出了與天然hTFF3N端序列一致的蛋白。可見,對宿主細胞的信號序列,并不一定能直接引用,尤其是酵母系統(tǒng)的信號切割不完全情況,需要對其做適當改變。引用外源信號肽時,同樣需要考慮這一點。最佳選擇是找出適當?shù)男盘栯?使其不僅能在酵母系統(tǒng)中引導外源蛋白高效分泌,同時還能被信號肽酶準確識別。3酵母信號肽的作用近年來,人們研究外源蛋白分泌時,發(fā)現(xiàn)了很多有趣且實用的分泌信號,能較大地促進外源蛋白分泌,如H.Uchida等在編碼hGH序列的下游,融合了桿菌的中性淀粉蛋白水解酶基因(npr),在E.coli中表達出具有高分泌活性的20kDa蛋白質(zhì)。另外,分泌載體的構(gòu)建在酶母表達體系中顯得尤為重要,因其為大量生產(chǎn)用于治療的人源性蛋白提供了技術(shù)依據(jù)。畢赤酵母中,Aoxl啟動子能高效啟動Aoxl基因的表達,在信號肽的起始密碼子ATG后增加Aoxl基因ATG后1~10個氨基酸,同時酵母偏愛密碼子的使用,可不同程度的提高目的蛋白質(zhì)的分泌效率;另外沒有使用酵母偏愛密碼子時,啟動子與信號肽序列直間接的連接對表達也有一定的促進作用。HyunAhKang等在釀酒酵母中高效表達人α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)時發(fā)現(xiàn),來源于克魯維酵母的菊粉酶信號肽序列(INU),可幫助構(gòu)建高效釀酒酵母附加型分泌表達載體。在酵母分泌系統(tǒng)中,α因子信號序列,主要對小分子多肽和蛋白分泌起作用,對大分子蛋白質(zhì)而言,分泌效果并不令人滿意。菊粉酶信號肽序列(INU)可幫助解決這一問題,同時INU信號肽的C端是Lys_Arg,外源蛋白分泌出胞外時,信號肽酶KEX2的酶切點恰能識別,因而利用INU,酵母表達產(chǎn)物不存在信號肽切割不完全情況。HyunAhKang實驗結(jié)果表明,釀酒酵母中INU1不僅可引導非糖基化蛋白如人脂肪皮質(zhì)1(37kDa)、和白介素2(17kDa)分泌,還能高效引導大分子糖蛋白如人α1-AT(45kDa)分泌。在INU信號肽的引導下,酵母內(nèi)合成的人α1-AT約有70%分泌胞外,并且不帶有多余的氨基酸序列。與其它多種信號序列相比,帶有GAL10促進子的菊粉酶(INU)信號體系是高效分泌系統(tǒng)中最有效分泌的信號序列之一,并且可有效應用于酵母系統(tǒng),獲得大量、正確的蛋白質(zhì)分子。4外源蛋白雞和內(nèi)酰胺hgcsf從信號肽定義上嚴格的認為,分泌增強子并不能歸為信號肽,它必須以其它信號肽為前導肽,才能發(fā)揮增強作用,但其作用不容忽視。據(jù)報道,人白介素-1β(humaninterleukinlbetahIL-1β)是非常有效的增強子,盡管它缺少特異性信號序列,但在釀酒酵母中仍然能自然分泌出胞。分泌過程中,起關(guān)鍵作用的是N端24個氨基酸殘基。JeewonLee等人利用hIL-1β作為分泌增強子,在重組酵母中表達分泌治療性人粒細胞集落刺落因子(hG_CSF)和人生長激素(hGH)。載體構(gòu)建中,將hIL_1βN端24個氨基酸殘基編碼序列與外源基因融合,并以來源于克魯維酵母的內(nèi)毒素(killertoxin)信號序列為前導肽,與誘導性UASgal/Mfαl促進子一起構(gòu)成分泌載體的表達盒,構(gòu)建載體pIL20GC(pIL20xGH),對照載體為pktGC(pktXGC)。通過對酵母細胞內(nèi)、外hG_CSF水平分析顯示,重組質(zhì)粒pIL20GC中,hG_CSF的分泌水平明顯高于對照質(zhì)粒pktGC中的水平。hIL_1β+的宿主細胞中,hG_CSF的合成與分泌可持續(xù)24小時。24小時之后,合成的hG_CSF蛋白約有40%分泌至培養(yǎng)基中,胞外蛋白水平可增至20~40mg/L。相反,hIL-1β-的重組宿主細胞中,盡管誘導后期hG_CSF仍會持續(xù)增加,但基本不會分泌出細胞。同時,對hGH蛋白的分泌結(jié)果表明:胞外hGH的積累水平最大可達到1.3g/L,pIL20xGH質(zhì)粒穩(wěn)定性可達80%。在表達上述兩種外源蛋白時,如果在培養(yǎng)基中添加衣霉素,均會抑制hIL-1βN-糖基化殘基活性,雖然宿主本身的蛋白可繼續(xù)分泌,但兩種外源蛋白尤其hGH的分泌幾乎為零?？梢?hIL-1β中N-糖基化殘基在重組釀酒酵母的增強分泌方面,起到了至關(guān)重要的作用。盡管酵母表達的外源蛋白有毒性小、易回收純化和糖基化完全等優(yōu)點,但多種外源蛋白在釀酒酵母中的分泌效率很低,因而其利用率并不如E.coli?，F(xiàn)今hIL-1β的利用,使釀酒酵母表達系統(tǒng)不僅能高效分泌hG-CSF、hGH和牛腸激酶,對其它外源蛋白的分泌也有較大增強作用。5hdef信號通路信號肽不僅能引導分泌蛋白或膜蛋白出胞,還能引導蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細胞器進行正確定位。以特定的細胞器為靶點,是未來新藥研究的方向;因而尋找定位性強或能改變分泌途徑的信號序列顯得很重要,以使外源蛋白在特定的位點發(fā)揮重要功效。據(jù)報道,殘留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)其C端都帶有特異性的定位信號KDEL和HDEL,這些定位信號可以使一些蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。目前已證明,這些定位信號廣泛存在于動植物細胞及酵母中。KarinKaletta等人研究發(fā)現(xiàn),存在于西紅柿細胞液泡外RNaseLX的C端帶有一個四肽HDEF,其功能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上定位信號相似。為測定HDEF對靶蛋白的定位能力,他們構(gòu)建了四種基因序列,其中一種是完整RNaseLX基因序列,兩種為RNaseLX序列C端分別除去了HDEF基因編碼和STNDDHDEF基因編碼后的序列,另外一種FB7-1△VTP則刪除了幾丁質(zhì)酶編碼,但C端融合HDEF基因序列。這四種外源基因分別在釀酒酵母中表達,發(fā)現(xiàn)帶有HDEF基因序列的兩種酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量積累,相反,不帶有這種基因序列的表達產(chǎn)物大量分泌出胞。由此可見,HDEF可以改變外源蛋白的分泌途徑,具有重要的靶蛋白定位分泌信號功能。顯而易見,如果可以充分認識信號序列本質(zhì),將可能找到更多的引導外源蛋白分泌途徑的信號序列,這將為定位特異靶點的新藥研究開辟全新領(lǐng)域。綜上所述,人類基因組計劃的完成,使人們能夠推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)運情況,這將為我們解釋疾病發(fā)病過程、提出新的治療方法奠定基礎。目前已有蛋白質(zhì)類如胰島素、生長激素、紅細胞生長素和干擾素等生物制劑。細菌雖常被作為表達蛋白質(zhì)藥物的宿主,但為了合成具有特定功能的活性人源性蛋白質(zhì),需要采用更高級的真核細胞如酵母。但相