高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定中藥鎖陽(yáng)中沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定中藥鎖陽(yáng)中沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量

鎖陽(yáng)通常被稱為“不老藥”，也稱為銹鐵棒、地毛球和羊圈拉。這是鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)cyboriuscyborius的干燥肉質(zhì)莖，分布在甘肅省、新疆、內(nèi)蒙古、青海、寧夏等地。產(chǎn)于河西走道沙地、騰格里沙漠和渾山達(dá)克沙地西部。尤其是甘肅河西走道走廊生產(chǎn)的鎖陽(yáng)，由于其良好的療效，被歷代中醫(yī)視為鎖陽(yáng)道教的發(fā)源地。它具有補(bǔ)充腎陽(yáng)、益血、潤(rùn)腸排便的功效。臨床上主要用于腰膝酸軟、陽(yáng)虛、滑精、腸干渴、大便等疾病，療效明顯。近年來(lái),隨著光譜技術(shù)的發(fā)展,鎖陽(yáng)的化學(xué)成分才被逐步揭示,而且對(duì)其藥理作用也有了更廣泛的認(rèn)識(shí)。這些對(duì)測(cè)定鎖陽(yáng)的有效成分,建立鎖陽(yáng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用鎖陽(yáng)資源都具重要的意義。研究表明,鎖陽(yáng)能夠促進(jìn)人體細(xì)胞再生和新陳代謝,增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力,在防癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、防治心血管疾病、治療白細(xì)胞減少等方面具有重要價(jià)值。鎖陽(yáng)中含有的沒(méi)食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用;原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用,在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性,它們的藥理作用與鎖陽(yáng)的主要藥理作用相吻合。目前在國(guó)內(nèi),鎖陽(yáng)中沒(méi)食子酸、原兒茶酸的HPLC含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。筆者以沒(méi)食子酸、原兒茶酸為對(duì)照品,建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定鎖陽(yáng)中沒(méi)食子酸、原兒茶酸的含量測(cè)定方法,方法簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可為控制該藥材和飲片的內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù),從而為鎖陽(yáng)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1dad治理裝置Agilent1100高效液相色譜儀:包括G1311A四元泵,G1315ADAD檢測(cè)器,Agilent1100化學(xué)工作站;U-3900H日立紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);十萬(wàn)分之一電子天平(Metler-D2025型);超聲波提取器(SB2200-T,上海必能信超聲有限公司)。1.2對(duì)照品和分析純沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110831-200302);原兒茶酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110809-200102);乙腈為色譜純;水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;鎖陽(yáng)藥材由蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為CynomoriumsongaricumRupr。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相的優(yōu)化260nm;流動(dòng)相:乙腈-水-冰醋酸(5∶95∶0.1);流速:0.8mL·min-1;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10μL;在流動(dòng)相的優(yōu)化中,選用了乙腈-水-冰醋酸系統(tǒng)的不同配比(15∶85∶0.1,10∶90∶0.1,10∶100∶0.1和5∶95∶0.1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的降低,沒(méi)食子酸和原兒茶酸的保留時(shí)間增加,并與雜質(zhì)峰的分離度增大,當(dāng)乙腈-水-冰醋酸為5∶95∶0.1時(shí),能夠獲得好的分離效果和短的分離時(shí)間,所以選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相;外標(biāo)法定量(見(jiàn)圖1)。2.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品13.00mg,置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液;精密稱取原兒茶酸對(duì)照品13.32mg,置于50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,作為原兒茶酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液;精密吸取上述2種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各5mL,置于50mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品混合溶液(每1mL含沒(méi)食子酸26.00μg,每1mL含原兒茶酸26.64μg)。2.3樣品溶液的制備取供試品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0g,精密稱定,加水50mL回流提取2次,每次1h,合并提取液,水浴濃縮至約10mL,加鹽酸調(diào)節(jié)pH至3,置分液漏斗中,用乙醚輕輕振搖提取4次(25,25,25和20mL),合并提取液,低溫?fù)]干乙醚,殘?jiān)昧鲃?dòng)相洗至10mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,超聲處理10min,放至室溫,備用。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍精密吸取上述2種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.0,4.0,6.0,8.0和10.0mL(分別含沒(méi)食子酸0.520,1.040,1.560,2.080和2.600mg;含原兒茶酸0.533,1.066,1.599,2.132和2.665mg),分別置于50mL量瓶中,用流動(dòng)相做梯度稀釋,超聲處理10min,放至室溫。精密吸取上述5種對(duì)照品混合溶液各10μL,注入液相色譜儀,測(cè)定上述2種對(duì)照品的峰面積值。以對(duì)照品進(jìn)樣量(m,μg)為橫坐標(biāo),以峰面積值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得沒(méi)食子酸的回歸方程為:A1=1994.9m1+15.6,r1=0.9998;原兒茶酸的回歸方程為:A2=3774.0m2+36.2,r2=0.9999。結(jié)果表明,沒(méi)食子酸和原兒茶酸對(duì)照品進(jìn)樣量分別在0.104～0.520和0.107～0.538μg時(shí),與峰面積值具有良好的線性關(guān)系。按信噪比S/N=3,最低檢出限均為0.005和0.005μg。2.5儀器精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品混合溶液10μL,在確定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積值,求得沒(méi)食子酸和原兒茶酸RSD分別為0.75%和0.68%,儀器精密度良好。2.6算法重現(xiàn)性結(jié)果取同一樣品(甘肅酒泉)6份,按2.3項(xiàng)下制備,進(jìn)樣,分析,結(jié)果平均含量沒(méi)食子酸為0.30mg·g-1,RSD為0.77%,原兒茶酸為0.39mg·g-1,RSD為0.65%,說(shuō)明本方法的重現(xiàn)性良好。2.7原兒茶酸含量取上述樣品在4,8,12,24和48h分別測(cè)定,結(jié)果24h內(nèi)沒(méi)食子酸平均含量為0.30mg·g-1,RSD為0.77%;48h內(nèi)平均含量為0.30mg·g-1,RSD為0.56%;24h內(nèi)原兒茶酸平均含量為0.39mg·g-1,RSD為0.65%;48h內(nèi)平均含量為0.38mg·g-1,RSD為0.68%,說(shuō)明被測(cè)樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.8加樣回收率和精密度取已知含量的樣品(甘肅酒泉),共5份。各加入一定量的對(duì)照品溶液,按確定的方法提取得到樣品溶液,按2.3項(xiàng)下制備,進(jìn)樣,分析,結(jié)果沒(méi)食子酸的加樣回收率為97.15%,RSD為1.61%;原兒茶酸的加樣回收率為97.26%,RSD為0.89%。2.9鎖陽(yáng)藥材、飲片的鎖陽(yáng)體測(cè)定照供試品溶液制備方法制備15批供試品溶液,分別取配制好的對(duì)照品溶液和供試品溶液,精密吸取10μL進(jìn)樣,用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算,被測(cè)鎖陽(yáng)藥材、飲片中沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。3提取方法的確定系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)時(shí),由DAD檢測(cè)器收集到的信息可知,沒(méi)食子酸在218和273nm處均有最大吸收;原兒茶酸在220,260和295nm處均有最大吸收,且在260nm處的靈敏度較高,沒(méi)食子酸在此波長(zhǎng)處也有很好的吸收,故確定260nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在確定色譜分離條件時(shí),對(duì)甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等不同流動(dòng)相進(jìn)行多次選擇比較,確定本文的檢測(cè)條件,沒(méi)食子酸、原兒茶酸能夠達(dá)到基線分離,峰形好,保留時(shí)間相對(duì)適中,分離度較好,與甲醇-水-冰醋酸液比較,柱壓明顯降低,其它成分無(wú)干擾。筆者嘗試以回流、超聲、冷浸提取方法進(jìn)行比較,回流方法可有效提取原兒茶酸,提取效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于超聲、冷浸提取法,所以采用回流提取法。以甲醇-冰醋酸(100∶1),30%乙醇-冰醋酸(100∶1),50%乙醇-冰醋酸(100∶1),0.1mol·L-1鹽酸溶液、水等作為回流提取溶劑;乙醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇(5∶1)作為萃取溶劑;提取時(shí)間、提取體積作為影響因素,對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)選實(shí)驗(yàn),從優(yōu)化結(jié)果來(lái)看,最終確定采用水回流提取,以乙醚萃取,蒸干溶劑,加定量流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣的方法進(jìn)行測(cè)定,可有效分離出沒(méi)食子酸、原兒茶酸,減少了部分非測(cè)定物質(zhì)的干擾。萃取次數(shù)的比較,選定萃取4次,結(jié)果表明4次可完全提出,減少提取次數(shù),會(huì)增大測(cè)定誤差。測(cè)定結(jié)果表明,10批藥材和5批飲片中均含有沒(méi)食子酸