GB 4789.36-2016 大腸埃希氏菌O157：H7NM檢驗(yàn) 好

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大學(xué)趙廣英2016-12-23發(fā)布2017-06-23實(shí)施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大學(xué)趙廣英2016-12-23發(fā)布2017-06-23實(shí)施NM：沒有鞭毛，無動(dòng)力菌株重點(diǎn)：檢驗(yàn)程序及其各部分的原理難點(diǎn)：全面掌握檢驗(yàn)程序并理解其各部分的原理課時(shí)數(shù)：1課時(shí)CompanyLogo致瀉大腸埃希氏菌有5類：

腸道致病性大腸埃希氏菌(

EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC）腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EnteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC）

產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC）

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(

Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)

***(腸道出血性大腸埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)

腸道集聚性大腸埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)

O157:H7/NM是EHEC的代表，近幾年危害嚴(yán)重，受到重視！O（菌體）抗原；H（鞭毛）抗原；K（莢膜）抗原；F（菌毛）抗原CompanyLogo序1.流行病學(xué)簡述2.生物學(xué)特性3.培養(yǎng)基和試劑4.檢驗(yàn)程序及方法

image/e_colio157(1).jpg第一部分致病菌概述E.coliO157:H7概況病特征：引起出血性腸炎的血性腹瀉、腸痙攣，溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴(yán)重的并發(fā)癥。后者病情兇險(xiǎn)，病死率極高。疫情：腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)

O157:H7感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病。包括我國在內(nèi)的世界許多國家都有疫情發(fā)生（食物中毒）序CompanyLogo

首發(fā)：

1982年美國牛肉中毒；依據(jù)1999年的評(píng)估,美國每年發(fā)生73000例感染,并造成61人死亡。雖然此疾病大多與食用未完全煎熟的受污染漢堡包肉餅有關(guān),也多見于食用受污染的生豆芽或新鮮多葉蔬菜而感染,例如萵苣葉、菠菜、生菜等。

擴(kuò)散和蔓延：相繼在英國、加拿大、日本等許多個(gè)國家引起腹瀉暴發(fā)和流行。歷史CompanyLogo

*1993年，JackInTheBox(美國家喻戶曉的知名快餐連鎖店之一,引導(dǎo)漢堡潮流)快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人（以兒童為主）食物中毒，并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠(yuǎn)揚(yáng)。5*2001年夏天，在大腸桿菌O157:H7爆發(fā)殃及35人之后，北美乃至全球最大的食品公司之一

ConAgraFoods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。

事件CompanyLogo*1998年，佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。

*1996年5-8月，日本中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157集體中毒事件，波及44個(gè)地區(qū)，7萬例，死亡12人.與芽菜有關(guān)。CompanyLogo2014年08月10日日本靜岡市政府９日宣布，在該市發(fā)生大規(guī)模食物中毒事件后，從患者體內(nèi)檢測出了腸出血性大腸桿菌Ｏ１５７，截至９日，發(fā)病者達(dá)到４４９人。這是１０年來由出血性大腸桿菌Ｏ１５７導(dǎo)致的最大規(guī)模的集體食物中毒事件。7月26日靜岡市煙花大會(huì)的游客吃了攤販賣的冰腌小黃瓜的集體食物中毒案，總計(jì)有453人被檢驗(yàn)出含出血性大腸桿菌O157，其中108人病情較嚴(yán)重住院。有4人出現(xiàn)溶血性尿毒癥候群(HUS)。CompanyLogo1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測，已陸續(xù)有十余個(gè)省份在市售食品、進(jìn)口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌，并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7，患者表現(xiàn)腹瀉、急性腎功能衰竭，因多器官受損死亡。2000年，衛(wèi)生部發(fā)布了

《全國腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉監(jiān)測方案（試行）》，為進(jìn)一步加強(qiáng)我國重點(diǎn)地區(qū)的監(jiān)測工作，特制訂此方案。我國疫情CompanyLogo1.流行病學(xué)簡述O157:H7屬于腸出血性大腸桿菌。發(fā)病季節(jié)性強(qiáng)，多發(fā)生于夏秋兩季，7-8月為發(fā)病高峰。它主要通過污染的食物像人類傳播。一般認(rèn)為100～200個(gè)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞就能使人中毒，而其他致瀉性大腸桿菌通過食物感染人需要100萬個(gè)以上的細(xì)胞。其致病機(jī)理包括黏附和產(chǎn)毒兩方面。腸痙攣和血性腹瀉是O157:H7感染后的典型癥狀。易感人群多為5歲以下小孩及老人。CompanyLogo2.生物學(xué)特性G-，無芽胞，有鞭毛和菌毛，需氧兼性厭氧中小桿菌。

genomics/images/e_coli_200.jpg1)形態(tài)與染色CompanyLogo2)生長特性耐低溫能在冰箱內(nèi)長期生存在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月對氯敏感被1mg/L的余氯濃度殺滅不耐熱75℃1min即被滅活EHECO157:H7具有較強(qiáng)的耐酸性pH2.5-3.0，37℃可耐受5小時(shí)最適生長溫度為33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生長不良，45.5℃不生長CompanyLogo3）EHECO157:H7/NM

生化反應(yīng)特性MR-VP試驗(yàn)纖維二糖發(fā)酵氧化酶試驗(yàn)+MR(+)VP(-)--山梨醇發(fā)酵

賴氨酸脫羧酶

鳥氨酸脫羧酶棉子糖發(fā)酵陰性或遲緩發(fā)酵，其它EC＋陽性（紫色）

陽性（紫色）+三糖鐵瓊脂

MUG試驗(yàn)4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷動(dòng)力試驗(yàn)西蒙氏檸檬酸鹽底及斜面黃色，H2S(-)

陰性有動(dòng)力或無動(dòng)力-靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)

注：紅色字的是其區(qū)別于其它大腸埃希氏菌的特性O(shè)157:H7區(qū)別其它大腸埃希氏菌的特點(diǎn)①不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇；②4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷陰性；③44-45.5℃不易生長；④產(chǎn)大量Vero毒素（VT/類志賀氏毒素，SLT）雖然有uidA基因，但其編碼的β-葡萄糖醛酸酶無活性，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）產(chǎn)生熒光，即MUG陰性。產(chǎn)生大量的Vero毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。EHEC除其代表菌株O157:H7外，還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大學(xué)趙廣英2016-12-23發(fā)布2017-06-23實(shí)施前言本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.36—2008相比,主要變化如下:—標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)”;—修改了標(biāo)準(zhǔn)的范圍;—修改了設(shè)備和材料;—修改了培養(yǎng)基和生化反應(yīng)的文字描述;—?jiǎng)h除“第二法免疫磁珠捕獲法的原理”;—?jiǎng)h除“第三法全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法”;—?jiǎng)h除“第四法全自動(dòng)病原菌檢測系統(tǒng)篩選法”。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢驗(yàn)。CompanyLogo2設(shè)備和材料2.1~2.10略2.11長波紫外光燈:365nm,功率≤6W。

2.12微量離心管:1.5mL或2.0mL。2.13磁板、磁板架、樣品混合器。2.14微生物鑒定系統(tǒng)

3培養(yǎng)基和試劑3.1改良EC肉湯(mEC+n):見A.1。3.2改良山梨醇麥康凱瓊脂(CT-SMAC):見A.2。

3.3三糖鐵瓊脂(TSI):見A.3。3.6月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG(MUG-LST):見A.6。3.10亞碲酸鉀(AR級(jí))。3.11頭孢克肟(Cefixime)。3.12大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。3.13大腸埃希氏菌O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑。3.14鑒定試劑盒。3.15抗E.coliO157免疫磁珠大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。CompanyLogo3.1改良EC肉湯（mEC+n)

:見A.1。

——用于O157選擇性增菌

主要成分解析：

3

號(hào)膽鹽抑雜菌

乳糖

產(chǎn)酸產(chǎn)氣

新生霉素鈉鹽溶液抑雜菌3.2改良山梨醇麥康凱（CT-SMAC)瓊脂：見A.2。

——依據(jù)最新標(biāo)準(zhǔn)制作，主要用于食品和食物中毒樣品中大腸埃希氏菌O157

:

H7

和O157

:

NM

的檢驗(yàn)

，分離培養(yǎng)用，36

℃

士1

℃

培養(yǎng)18h

一24h

。

主要成分解析：山梨醇

陰性或遲發(fā)酵

3

號(hào)膽鹽

抑雜菌

中性紅

顯色劑6.8～8.0紅~黃~橙

結(jié)晶紫

抑雜菌典型菌落為不發(fā)酵山梨醇（其他大腸桿菌為陽性）的圓形、光滑、較小，中心呈現(xiàn)較暗的原色小S菌落；發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色；E.coli

O157:H7和O157:H7/NM為陰性/遲緩

3.10-A.2.2亞碲酸鉀（AR

級(jí)）

3.11-A.2.3頭孢克肟（Ceflxitne)

CompanyLogo加到3.2中，抑制雜菌。有效儲(chǔ)藏期：-20℃一年；

2℃--8℃，14d。

3.3三糖鐵瓊脂（TSI）見A.3。成分：葡萄糖：乳糖：蔗糖＝1：10：10；酚紅:pH6.8--8.4(黃-紅)；分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫和鐵鹽（硫酸亞鐵銨）形成黑色；制備成柱狀斜面功能：判斷分解三種糖的能力；是否產(chǎn)生硫化氫。

E.ColiO157H7在TSI

瓊脂中，分解葡萄糖和乳糖，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫（H2S

）；3.4營養(yǎng)瓊脂A.4和3.5半固體瓊脂A.5略3.6

月桂基磺酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG

(LST－MUG):A.6(-)

LST－MUG含4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG

)

本菌不含活性β-D-葡萄糖醛酸苷酶即(-)

月桂基硫酸鹽（陰離子表面活性劑，主要作用是抑制G+菌）

乳糖＋

在CT-SMAC

和改良CHROMagar

O157

顯色瓊脂平板上挑取5

-10

個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSI

瓊脂(三糖鐵瓊脂)，并接種MUG-LST肉湯，36

℃

士1

℃

培養(yǎng)18h-24h

.置MUG-LST

肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生者為O157菌陽性結(jié)果（其他E.Coli有葡萄糖醛酸苷酶－有熒光產(chǎn)生），有熒光產(chǎn)生者為O157菌陰性結(jié)果；對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36

℃

士1

℃

培養(yǎng)18h

一24h

，并進(jìn)行后續(xù)鑒定，如必要時(shí)進(jìn)行：3.7氧化酶試劑：A.7(-)3.8

革蘭氏染色液：A.8

(-)

3.9PBS–Tween20洗液A.9；3.10和3.11在前面。3.12大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。3.13大腸埃希氏菌O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑。3.14鑒定試劑盒。3.15抗E.coliO157免疫磁珠第一法常規(guī)檢驗(yàn)法4.檢驗(yàn)程序檢樣25g(mL)+225mL

mEC+n肉湯，均質(zhì)

36℃±1℃18h～24hCT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板36℃±1℃18h～24h挑取可疑菌落5個(gè)～10個(gè)，氧化酶-，G-

中小桿菌接種TSI，氧化酶—，G—MUG-LST36℃±1℃18h～24h實(shí)驗(yàn)陽性實(shí)驗(yàn)陰性非O157血清學(xué)試驗(yàn)生化試驗(yàn)報(bào)告初步生化實(shí)驗(yàn)三糖鐵黃色可產(chǎn)氣其它大腸桿菌有葡萄糖醛酸苷酶＋；O157—選擇性增菌改良山梨醇不/遲緩發(fā)酵，中心呈現(xiàn)較暗的原色小S菌落分離鑒別顯色培養(yǎng)無熒光－－純培養(yǎng)改良山梨醇麥康凱微量多項(xiàng)生化試劑盒玻片凝集實(shí)驗(yàn)CompanyLogo5操作步驟說明增菌改良EC

肉湯（mEC+n

)分離劃線或取0.1

mL

涂布接種于CT-SMAC

平板和改CHROMagar

O157

弧菌顯色瓊脂平板上注意：在CT-SMAC

平板上，典型O157菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色；其它菌發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色

stories/E.%20coli%20O157.jpg在改良CHROMagar

O157

桿菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色—紫紅色，邊緣無色或淺灰色

CompanyLogo3.初步生化試驗(yàn)

在上述平板上挑取5

個(gè)一10

個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSI

瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST

肉湯，培養(yǎng)。

必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI

瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫（H2S

）。置MUG-LST

肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生者為O157陽性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果；對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純培養(yǎng)，并進(jìn)行下列鑒定。操作步驟說明CompanyLogo操作步驟說明4.1

血清學(xué)試驗(yàn)在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157

:

H7

標(biāo)準(zhǔn)血清或O157

乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。對于H7

因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3

次，動(dòng)力試驗(yàn)陰性，H7

因子血清凝集陰性者，確定為無動(dòng)力株。

4.鑒定CompanyLogo操作步驟說明4.2

生化試驗(yàn)

用AP120E

生化鑒定試劑盒或VITEK-GNI+檢測卡，按照生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行.EHECO157:H7/NM生化反應(yīng)特性第二法

免疫磁珠捕獲法

CompanyLogoCompanyLogo7檢驗(yàn)程序檢樣25g/mL+225mLmEC肉湯，均質(zhì)O157免疫磁珠捕獲富集CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板挑取可疑菌落5個(gè)~10個(gè)接種TSI，氧化酶陰性，G—MUG-LST陽性血清學(xué)實(shí)驗(yàn)生化試驗(yàn)報(bào)告非E.coliO157陰性36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h鑒別培養(yǎng)改良山梨醇麥康凱無熒光玻片凝集實(shí)驗(yàn)；H因子血清不凝者，穿刺半固體檢查動(dòng)力，傳代3次仍不凝者為無動(dòng)力株（NM）原理（新國標(biāo)略）

免疫磁珠捕獲技術(shù)是通過對目的細(xì)菌進(jìn)行選擇性增菌，然后利用免疫磁珠進(jìn)行選擇性捕獲的方法。捕獲的目的細(xì)菌被結(jié)合到由抗體包被的磁性顆粒上，收集后再將磁性顆粒涂布到選擇性瓊脂平板上進(jìn)行分離。在CT

-SMAC

平板上生長的可疑的大腸埃希氏菌O157,因?yàn)椴环纸馍嚼娲?，或在E.coli

O157顯色瓊脂平板上產(chǎn)生特定的酶促反應(yīng)呈現(xiàn)顏色變化，而與其他細(xì)菌相區(qū)別。免疫磁珠的應(yīng)用，特別是在樣品含有大量雜菌時(shí)，對檢樣中含有少量的大腸埃希氏菌O157：H7/NM的檢出提供了更大的可能性。

檢驗(yàn)程序基本同培養(yǎng)法，只是在選擇性增菌后利用了免疫磁珠進(jìn)行選擇性捕獲富集

復(fù)習(xí)思考題一、判斷題1、E.coliO157:H7/NM是腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)的代表（）E.coliO157:H7/NM是腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)的唯一血清型（）E.coliO157:H7/NM腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)的代表（）E.coliO157:H7/引起特征性的病癥是腹瀉、腸痙攣、出血性腸炎腹瀉，溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴(yán)重的并發(fā)征。后者病情兇險(xiǎn)，病死率極高。二、E.coliO157:H7區(qū)別于其他E.coli的生化特性：E.coliO157:H7區(qū)別于其他E.coli的生化特性是①不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇；②無有活性的β-葡萄糖醛酸酶，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）產(chǎn)生熒光，即MUG陰性；③44-45.5℃不易生長；④產(chǎn)生大量的Vero毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。三、免疫磁珠的作用？CompanyLogoCompanyLogo天鵝花

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第三法

全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法1原理mini

VIDAS

或VIDAs

EscherichiacoliO157分析，是在自動(dòng)VIDAS

儀器上進(jìn)行的雙抗體夾心酶聯(lián)熒光免疫分析（ELFA

）方法。固相容器（SPR

）用抗大腸埃希氏菌O157

抗體包被，各種試劑均封閉在試劑條內(nèi)。mini

VIDAS

或VIDAS

和E.coli

O157

試劑條（VIDAS

ECO

）SPR試劑條原理煮沸過的增菌肉湯加入試條孔后，在特定時(shí)間內(nèi)樣本中的O157

抗原與包被在SPR

內(nèi)部的O157

抗體結(jié)