五味子油對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、胰島細(xì)胞形態(tài)及功能的影響

五味子油對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、胰島細(xì)胞形態(tài)及功能的影響

五味子是木蘭科植物的五味子schidandarytheetwils（turcz.）bail.或華中五味子schidandarsphendararewd。干燥成熟的水果是傳統(tǒng)中醫(yī)，味道酸澀、性溫、肺、心、腎經(jīng)，具有收斂、收斂、益氣、生津、補(bǔ)腎寧心等功效。五味子中含有木脂素、多糖、揮發(fā)油、脂肪酸、維生素和氨基酸等成分,五味子油的主要成分為木脂素,是五味子中最主要的活性成分之一。五味子油對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠具有降血糖作用,但具體機(jī)制尚不清楚,而關(guān)于其對(duì)2型糖尿病大鼠的影響及機(jī)制研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)研究五味子油對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其機(jī)制,為研發(fā)有效的治療糖尿病藥物提供依據(jù)。1材料表面1.1藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)劑五味子為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所優(yōu)選新品種(擬名“優(yōu)紅01”),剝離果皮的種子用醋酸乙酯提取,低溫濃縮油狀物質(zhì)即為五味子油(含五味子醇甲2.344%、五味子乙素1.480%、五味子醇乙0.810%、五味子甲素0.522%、五味子乙素0.160%)。百泌達(dá)(Exenatide),美國(guó)BaxterPharmaceuticalSolutionsLLC,批號(hào)H20090382。鏈尿佐菌素(STZ),Sigma公司;血糖試劑盒,北京康化公司;胰島素試劑盒,天津九鼎生物技術(shù)有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量200~250g,購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)2007-003。大鼠正常飼料含有53%碳水化合物、5%脂肪、23%蛋白;高脂飼料含48%碳水化合物、22%脂肪、20%蛋白。1.3主要設(shè)備酶標(biāo)儀,TECAN公司;GC—2100型γ放射免疫計(jì)數(shù)儀,中國(guó)科大中佳公司產(chǎn)品。2方法2.1給藥劑量及給藥間隔Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)抽取8只作為對(duì)照組,以普通飼料喂養(yǎng),其余大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)4周后,ip小劑量STZ30mg/kg,共給藥2次,2次給藥間隔1周。并于STZ誘導(dǎo)并繼續(xù)喂飼高脂飼料2周后檢測(cè)空腹血糖,以空腹血糖≥7.8mmol/L作為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。2.2模型組和百泌達(dá)陽(yáng)性組、前藥劑量對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響將模型制備成功的大鼠按血糖水平(7.8~16.0mmol/L)分為5組,每組8只,分別為模型組、百泌達(dá)陽(yáng)性對(duì)照組和五味子油高、中、低劑量組。在喂飼高脂飼料的同時(shí),陽(yáng)性對(duì)照組每日ip百泌達(dá)1.1μg/kg,五味子油3個(gè)劑量組分別ig五味子油1.0、0.5、0.25mg/kg,每日1次,連續(xù)給藥6周。2.3血樣、血糖水平檢測(cè)給藥6周后,大鼠禁食不禁水12~16h,ip烏拉坦100mg/kg麻醉,腹主動(dòng)脈取血約4~5mL并處死動(dòng)物。血樣于3500r/min離心10min,分離血清,分裝于EP管內(nèi),-70℃凍存待測(cè)。血糖水平檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作;放免法檢測(cè)血清胰島素水平,并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)[ISI,ISI=ln(FBG×FINS)-1,FBG為空腹血糖水平,FINS為空腹胰島素水平]。2.4組織切片的制備將胰腺剝?nèi)『罅⒓粗糜?0%福爾馬林固定液中固定24h,再于0.01mol/L的PBS溶液中浸泡12h,梯度乙醇脫水(梯度乙醇脫水后,用二甲苯置換組織切片中的乙醇),石蠟包埋,切片4μm,HE染色。中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察、拍照。2.5免疫組織化學(xué)法對(duì)胰腺胰島素的出現(xiàn)進(jìn)行了檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)S-P(鏈霉素抗生物素蛋白一過(guò)氧化物酶)法,按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)胰腺胰島素表達(dá)。2.6逆轉(zhuǎn)錄rt-pcr法從-80℃冰箱中取出胰腺組織標(biāo)本約100mg置入研缽內(nèi),液氮研磨,加入1mLTrigol,充分裂解,離心后加入200μL氯仿,振蕩混勻,室溫放置15min,4℃、12000r/min離心15min。吸取上層水相,加入0.5mL異丙醇混勻,-20℃放置30min,離心棄上清,RNA沉于管底,75%乙醇洗沉淀2次,用35μL氨基甲烷+乙二胺四乙酸緩沖液(TE緩沖液)溶解RNA樣品。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):RNA3μL,5×緩沖液4μL,10×dNTP2μL,Oligo(dT)1μL,逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL,焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O9.5μL。反應(yīng)程序:42℃、60min,95℃、5min,4℃、1~5min。PCR反應(yīng):cDNA1μL,引物F(20pmol/μL)0.5μL,引物R(20pmol/μL)0.5μL,2×Mix12.5μL,重蒸水10.5μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán)。胰島素引物序列:正向引物5’-ACCTTTGTGGTCCTCACCTG-3’,反向引物5’-GTGCAGCACTGATCCACAAT-3’,擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為205bp。PDX-1引物序列:正向引物5’-GGCTTAACCTAAACGCCACA-3’,反向引物5’-CAGTTGGGAGCCTGATTCTC-3’,擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為212bp。β-actin引物序列:正向引物5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’,反向引物5’-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3’,擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為444bp。用胰島素或PDX-1與內(nèi)參β-actin的積分吸光度比值表示胰島素或PDX-1mRNA的表達(dá)量。2.7統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以表示,組間比較采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1藥動(dòng)過(guò)速對(duì)大鼠空腹血糖的影響對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好,皮毛光澤,體質(zhì)量持續(xù)、穩(wěn)定上升。模型組大鼠給予STZ后,進(jìn)食量、飲水量增加,消瘦,精神萎靡,毛發(fā)稀落欠光澤,動(dòng)作遲緩。五味子油各劑量組大鼠給藥6周后,一般狀態(tài)好轉(zhuǎn),糖尿病癥狀明顯減輕。與對(duì)照組相比,模型組大鼠空腹血糖水平明顯上升(P<0.05);與模型組相比,五味子油高、中劑量組均可降低空腹血糖水平(P<0.05),其中高劑量組可使糖尿病大鼠空腹血糖恢復(fù)正常。結(jié)果見(jiàn)表1。3.2對(duì)大鼠血清胰島素水平的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清胰島素水平明顯降低(P<0.05),ISI明顯下降(P<0.05);與模型組相比,五味子油高劑量組大鼠在給藥6周后,血清胰島素水平明顯升高(P<0.05),ISI顯著提高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。3.3藥代大鼠胰島形態(tài)及人員胰島排列對(duì)照組和百泌達(dá)組大鼠胰島呈圓形或橢圓形團(tuán)索狀,邊界清晰,胰島內(nèi)β細(xì)胞分布均勻,排列緊密,胞漿豐富。模型組大鼠胰島數(shù)量減少,體積變小,邊界模糊,胰島內(nèi)β細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞腫脹、壞死,并可見(jiàn)空泡變性。五味子油各劑量組胰島相對(duì)完整,胰島邊界較清晰,β細(xì)胞數(shù)目增加,細(xì)胞形態(tài)較好,無(wú)明顯的腫脹及壞死。結(jié)果見(jiàn)圖1。3.4研磨對(duì)胰島陽(yáng)性顆粒染色的影響對(duì)照組和百泌達(dá)組大鼠胰島結(jié)構(gòu)完整、體積較大、邊界清晰,胰島素陽(yáng)性顆粒染色后為棕色,在胰島內(nèi)廣泛分布。模型組大鼠胰島大小不一,大部分胰島小、邊界不清晰,胰島素陽(yáng)性顆粒染色淺、數(shù)量較少。與模型組比較,五味子油各劑量組胰島體積增大,胰島內(nèi)陽(yáng)性染色顆粒明顯增加。結(jié)果見(jiàn)圖2。3.5對(duì)大鼠胰島素和pdx-1mrna表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,模型組大鼠胰島素和PDX-1mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與模型組相比,五味子油高劑量給藥6周后顯著增加糖尿病大鼠胰島素和PDX-1mRNA表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。4藥藥堅(jiān)持持續(xù)血糖對(duì)2型糖尿病大鼠血糖的抑制作用2型糖尿病是與環(huán)境和遺傳相關(guān)的復(fù)雜疾病,發(fā)病機(jī)制不清。在2型糖尿病發(fā)病過(guò)程中,持續(xù)高血糖是代謝嚴(yán)重紊亂的主要表現(xiàn)之一,因此高血糖是糖尿病控制不良的標(biāo)志,糖毒性可導(dǎo)致胰島素的合成與分泌減少。短期高血糖能促進(jìn)胰島β細(xì)胞內(nèi)PDX-1與胰島素基因的結(jié)合,使胰島素mRNA表達(dá)增加;但在長(zhǎng)期高血糖作用下,PDX-1和胰島素表達(dá)水平均下降。Alquobaili等研究也表明,持續(xù)高血糖能抑制PDX-1基因和胰島素基因表達(dá),PDX-1蛋白與胰島素基因啟動(dòng)子的結(jié)合也受到抑制,從而使胰島素的合成及分泌下降,胰島β細(xì)胞功能障礙。合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制和藥療的生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)。能體現(xiàn)因膳食改變引起的肥胖,進(jìn)而出現(xiàn)糖尿病綜合征特點(diǎn)的動(dòng)物模型是比較符合人糖尿病自然發(fā)病機(jī)制的模型。本實(shí)驗(yàn)以大鼠ipSTZ2次制備2型糖尿病模型,結(jié)果顯示,五味子油有很好的降血糖、促進(jìn)胰島素分泌的作用,尤其是高劑量組可恢復(fù)糖尿病大鼠血糖至正常水平,血清胰島素分泌水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異;五味子油還可使胰腺病理學(xué)改變減輕,胰