凝血因子缺乏癥患者及其家系中f基因空間構型分析

凝血因子缺乏癥患者及其家系中f基因空間構型分析

遺傳因素（f）缺陷是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，在世界各地得到了報道。已有報道200多例,涉及120多個不同的FⅦ基因突變位點。我們于2004年曾診斷過一個遺傳性FⅦ缺乏癥家系。為了確定該家系FⅦ基因突變類型,闡明其發(fā)病的分子機制,我們用聚合酶鏈反應(PCR)技術結合DNA測序及限制性內切酶譜分析,發(fā)現(xiàn)該FⅦ家系存在一個新的FⅦ基因突變類型。進一步用蛋白質空間構型模擬分析,發(fā)現(xiàn)該突變位于蛋白質分子表面,突變產(chǎn)生的空間位阻效應影響了FⅦ蛋白的結構和功能?，F(xiàn)將研究結果總結如下。對象和方法一、術后并發(fā)癥和凝血機制檢查先證者為女性,15歲,自幼經(jīng)常有自發(fā)性鼻出血、皮膚淤斑。7歲換牙時曾持續(xù)出血3～4d;10歲時因腰痛在外院診斷“先天性雙側輸尿管狹窄”,先后兩次經(jīng)膀胱鏡行“輸尿管氣囊擴張術”,術后1～2d出現(xiàn)大量血尿,不得不提前取出支架管,并需輸注血漿或冷沉淀劑后方可止血。12歲月經(jīng)初潮,量多,每次持續(xù)1周以上。2003年因腰痛自服“雙氯芬酸鈉緩釋膠囊”后出現(xiàn)惡心、反酸和嘔血而入我院,肝功能檢查正常,無膽道疾病及腸道疾病證據(jù),無雙香豆素類藥物攝入史,經(jīng)凝血機制檢查分析確診為遺傳性FⅦ缺乏癥。其父母非近親結婚,均健在,無出血史;其妹偶有鼻出血史,其弟無出血史。隨機選取100名無任何出凝血疾病的健康人作為正常對照,進行FⅦ基因突變分析。二、方法1.基因組dna提取在簽署知情同意書后,對先證者及其家系成員、正常對照抽取外周靜脈血5ml,枸櫞酸鈉抗凝,其中1ml用美國Gentra公司的PuregeneDNAisolation試劑盒抽提白細胞中基因組DNA,紫外分光光度計測DNA濃度,-70℃凍存?zhèn)溆?剩余4ml于4℃2000×g離心15min,分離乏血小板血漿,分裝后-70℃保存,用于凝血指標的測定。2.凝血酶活性測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、Fg及FⅡ:C、FⅤ:C、FⅦ:C、FⅩ:C均采用德國DADEBEHRING公司試劑盒,在CA1500型血液凝固分析儀上測定。3.pcr反應體系用于PCR擴增FⅦ基因片段(含8個外顯子及內含子剪接位點)的9對引物序列(由上海生工公司合成)及條件見文獻。PCR反應在ABI7000擴增儀上進行,50μl反應體系中包括:1×PCR緩沖液,1.5mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTP,上游引物和下游引物各0.25μmol/L,DNA模板約400ng,Taq酶1U(PCR反應試劑均為立陶宛Fermentas公司)。PCR產(chǎn)物5μl在2%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳,100bpDNA梯(加拿大BBI公司)作分子質量標準,紫外透射分析儀觀察結果。4.與美國ncbi基因庫的對比先證者及其家系的PCR擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司和上海英駿生物技術有限公司協(xié)助進行測序,用Chromas軟件將測序結果與美國NCBI基因庫所公布的GI180333和J02933序列進行對比(Blaster),尋找基因突變位點。對存在基因突變的序列反向測序加以證實。5.dna的純化將先證者及其家系成員,100例正常對照FⅦ基因第8號外顯子的PCR擴增產(chǎn)物進行純化(V-gene公司),純化的DNA片段用ECO91I酶切(37℃14h)。2%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳,100bpDNA梯(BBI公司)作分子質量標準,紫外透射分析儀觀察酶切結果并拍照。6.對蛋白質空間結構的模擬分析采用Cn3D軟件模擬分析FⅦ蛋白的三維結構,推測FⅦ基因突變影響蛋白質功能的可能機制。結果1.先證者之妹的f:c+c輕先證者的PT延長,FⅦ:C明顯降低,先證者之妹的FⅦ:C輕度降低。家系中其他成員的APTT、TT、Fg及FⅡ:C、FⅤ:C、FⅩ:C均正常(表1)。2.號外顯子第9733位核苷酸met181asn先證者FⅦ基因8號外顯子第10833位核苷酸發(fā)生A→G雜合性錯義突變,導致Met306Val;7號外顯子第9643位核苷酸發(fā)生C→A雜合性錯義突變,導致Thr181Asn。家系分析表明前者遺傳于母親,后者遺傳于父親。先證者之妹為A10833G雜合子(Met306Val);先證者之弟FⅦ基因為正常野生型(表1,圖1)。3.基地片段酶切鑒定由于A10833G是一種國際上尚未報道過的FⅦ基因新突變,為進一步證實這一變化是突變而非多態(tài)性,對先證者及其家系成員、100名正常人的FⅦ基因第8外顯子的PCR擴增產(chǎn)物——660bp的片段進行了酶切鑒定。正常情況下該660bp片段不能被ECO91Ⅰ酶切,電泳圖上僅表現(xiàn)為660bp單一片段;當發(fā)生A10833G突變時,此處出現(xiàn)了一個ECO91Ⅰ酶切位點,純合子突變可被切成333和327bp兩個片段,由于這兩個片段長度接近,在瓊脂糖凝膠電泳圖上無法分辨出來,僅表現(xiàn)為位于330bp左右的單一片段;雜合子突變在電泳圖上則為660和330bp兩個片段。利用這一特征進行鑒定分析,發(fā)現(xiàn)先證者及其母親、妹妹為A10833G雜合子,而其父親和弟弟不存在這一變化,與測序結果相符。100名正常人中也沒有發(fā)現(xiàn)這一變化,說明其不是多態(tài)性(圖2)。4.n基因突變對f蛋白功能的影響FⅦ分子模建(圖3)分析顯示Thr181Asn突變位于FⅦ蛋白分子的內部,對蛋白質功能無顯著影響;Met306Val突變位于FⅦ蛋白分子的表面,發(fā)生空間位阻效應從而影響蛋白質的功能。asn基因突變生理條件下,FⅦ是以無活性的酶原形式存在于血液循環(huán)中。血管損傷后釋放的組織因子(TF)可快速激活FⅦ,使之成為活化的FⅦa。FⅦa與TF一起參與外源性凝血途徑的啟動和凝血過程。FⅦ蛋白分子分為4個結構域:γ-羧基谷氨酸(Gla)區(qū)、兩個表皮生長因子樣區(qū)(EGF)和催化區(qū)。FⅦ基因改變將影響其結構和功能,從而導致臨床上FⅦ缺乏癥。遺傳性FⅦ缺乏癥的發(fā)病率約為1/500萬。FⅦ缺乏癥的臨床出血程度和FⅦ的凝血活性并不平行,純合性和雙雜合性的FⅦ基因突變,其FⅦ:C一般在1%～5%之間,臨床出血常較重;而單一雜合性突變FⅦ:C不低于30%,幾乎無臨床癥狀。但一些特殊位點的雜合突變可表現(xiàn)為中、輕度的臨床出血;某些多態(tài)性也可以導致FⅦ的水平降低,加重本癥的臨床出血。本研究在此家系中發(fā)現(xiàn)了C9643A和A10833G兩種突變。C9643A位于外顯子7,國外已有報道。A10833G位于突變發(fā)生率最高的外顯子8,是一種國際上尚未報道的突變。本研究對100名正常人進行篩選而未發(fā)現(xiàn)該突變,說明該突變是一種新的突變而非基因多態(tài)性。FⅦa-TF復合物結構分析顯示Thr181位于酶水解區(qū)域的內部,遠離表皮生長因子(EGF)2與TF結合表面及FⅦa的活化位點。Thr和Asn都是極中性氨基酸,等電點接近,因而Thr181Asn突變所引起的側鏈大小和極性的變化都很小;而在兔和鼠野生型FⅦ結構中這一位點并不是Thr,分別為Ser、Val;因而推測Thr181Asn可能不會對FⅦ的分泌和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,除非同時存在另一種突變。在Millar等報道中,先證者為Thr181Asn單一雜合子突變,FⅦ:C和FⅦ:Ag均為1%,但僅表現(xiàn)為輕度出血癥狀。在我們的研究中,先證者的父親為Thr181Asn單一雜合突變,FⅦ:C為82.7%,無任何出血癥狀;而先證者卻由于合并有另外一種突變表現(xiàn)為嚴重的出血。本研究報道的這一家系,出現(xiàn)單一Thr181Asn突變者并不影響FⅦ活性和臨床出血表型,顯然與Millar報道的不符。欲澄清該機制,FⅦ基因Thr181Asn突變的體外誘變或轉基因實驗可望回答這一問題。分子模擬圖顯示Met306位于FⅦ蛋白質分子結構的高度保守區(qū),即催化區(qū)的表面,距離EGF較近,當發(fā)生Met306Val突變時,由于Met與Val的極性和側鏈大小相差甚遠,可能通過影響FⅦ與TF結合而導致FⅦ功能異常。先證者FⅦ基因含有Met306Val和Thr181Asn雙雜合突變;而先證者的母親和妹妹均為單一Met306Val雜合突變,