抗生素類藥物分析

抗生素類藥物分析1整理課件第一節(jié)概述2整理課件一、抗生素的定義及特點◆低化學(xué)純度－同系物多、異構(gòu)體多、降解物多◆活性組分的變異性－生產(chǎn)過程中條件的變化◆不穩(wěn)定性－不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是指“生物在其生命活動中產(chǎn)生的，能在卑微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱〞3整理課件抗生素的分類β－內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素酰胺醇類抗生素－氯霉素抗腫瘤類抗生素其他抗生素二、抗生素類藥物的分類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分4整理課件三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性5整理課件6整理課件7整理課件8整理課件三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性◆1、耐藥性的種類固有耐藥性：天然耐藥性，由細(xì)菌染色體基因決定獲得性耐藥性：◆2、耐藥的機(jī)制〔1〕產(chǎn)生滅活酶，使抗菌藥失活如β-內(nèi)酰胺酶〔2〕抗菌藥物作用靶位改變〔3〕降低細(xì)菌外膜通透性〔4〕影響主動流出系統(tǒng)9整理課件10整理課件四、抗生素藥物的質(zhì)量分析鑒別試驗㈠1、官能團(tuán)的顯色反響－特殊基團(tuán)的反響2、光譜法－特征吸收3、色譜法－保存行為4、生物學(xué)方法－抗菌能力11整理課件㈡檢查1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查工程－水份、酸堿度等2、控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的檢查工程3、與臨床平安性密切相關(guān)的檢查工程－異常毒性、熱原等4、其他檢查工程－其他共存組分12整理課件㈢含量或效價測定1、微生物檢定法比濁法管碟瓊脂擴(kuò)散法－抑菌圈Potency:是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標(biāo)來判斷效價的一種方法方法13整理課件靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、的和新的可一次測定同類型抗生素的總效價－無需別離純化與臨床的應(yīng)用要求一致操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力誤差較大是結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多組分抗生素效價測定的首先方法優(yōu)點㈢含量或效價測定1、微生物檢定法缺點14整理課件2、物理化學(xué)法HPLCLC-MSUV容量法準(zhǔn)確可靠、專屬性高、操作簡單、省時、樣品用量少1、對結(jié)構(gòu)或提純的抗生素2、需要標(biāo)準(zhǔn)品對照儀器分析方法㈢含量或效價測定15整理課件第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素16整理課件β-內(nèi)酰胺類抗生素6-氨基青霉烷酸〔6-APA〕；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸〔7-ACA〕；頭孢菌素類；一、結(jié)構(gòu)及分類氫化噻嗪環(huán)氫化噻唑環(huán)17整理課件青霉素〔青霉素鉀、鈉〕18整理課件氨芐西林

〔氨芐青霉素〕19整理課件阿莫西林

〔羥氨芐青霉素〕20整理課件普魯卡因青霉素21整理課件頭孢氨芐22整理課件頭孢羥氨芐23整理課件㈡理化性質(zhì)1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性24整理課件酸性一、結(jié)構(gòu)特點與性質(zhì)Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

〔一〕羧基易溶于水

25整理課件與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素26整理課件〔二〕手性C頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡27整理課件

〔三〕共軛體系頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV28整理課件〔四〕β–內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性水溶液

不穩(wěn)定

枯燥純潔穩(wěn)定不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

含水量純度

29整理課件青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效〔四〕β–內(nèi)酰胺環(huán)30整理課件與含水量和純度密切相關(guān)青霉素的降解途徑31整理課件青霉素的降解產(chǎn)物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強(qiáng)酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強(qiáng)酸性-加熱青霉胺－強(qiáng)酸性-加熱/青霉素酶-重金屬降解產(chǎn)物32整理課件二、鑒別反響〔一〕顯色反響1、異羥肟酸鐵反響33整理課件2.茚三酮反響

α-氨基-氨基茚三酮

藍(lán)紫色34整理課件3.雙縮脲反響似肽鍵（開環(huán)分解）-內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫35整理課件36整理課件4.與重氮苯磺酸反響橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC〔偶合〕酚羥基頭孢哌酮37整理課件1.K+、Na+的火焰反響〔二〕各種鹽的反響

焰色→鮮黃色+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色+0.1%四苯硼鈉→↓白

K+38整理課件2.沉淀反響〔青霉素鹽〕遇酸→↓在過量HCl或有機(jī)溶劑中溶解白青霉素青霉素鈉

青霉素鉀

+H+39整理課件3.重氮化-偶合反響重氮化-偶合反響芳伯氨基40整理課件光譜法（三）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.5041整理課件42整理課件2、IR法3180cm-1

N-Hβ–內(nèi)酰胺

C=O1780cm-13470cm-1

O-H1690cm-1仲酰胺

C=O1250cm-1

C-O以阿莫西林為例43整理課件色譜法（四）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法44整理課件三、雜質(zhì)檢查藥物檢查工程檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體HPLC法

頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)反相TLC法

青霉素鉀〔鈉〕吸收度紫外分光光度法

45整理課件

1.頭孢他啶聚合物的測定分子排阻色譜法

固定相：葡聚糖凝膠G-10流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml

46整理課件1〕系統(tǒng)適用性試驗：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000、流動相A測定；重復(fù)性用對照品溶液、流動相B測定。N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%

2〕測定方法

進(jìn)樣供試液，用流動相A；進(jìn)樣對照液，用流動相B。以外標(biāo)法計算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得超過0.3%。47整理課件2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

固定相：ODS

流動相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇〔62:38〕

1〕頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對照品+流動相頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體。

2〕系統(tǒng)適用性試驗：各異構(gòu)體之間的R>1.5，以頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計算n>1500。48整理課件3〕異構(gòu)體：

相對保存時間1--被測物

2--標(biāo)準(zhǔn)物異構(gòu)體相對保存時間判斷B異構(gòu)體0.85供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積A異構(gòu)體1.0與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng)為0.48~0.55。異構(gòu)體A異構(gòu)體B頭孢呋辛49整理課件3.頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法

固定相：活化后的硅膠G板置5%〔V/V〕正十四烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干展開劑：0.1mol/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉-丙酮〔120：80：3〕

供試液：本品50mg/ml

對照液〔1〕：本品0.5mg/ml

對照液〔2〕：α-苯甘氨酸0.5mg/ml

對照液〔3〕：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸0.5mg/ml50整理課件結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點，與對照液〔2〕〔3〕位置相同上所的斑點比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑點，與對照液〔1〕所顯的主斑點比較，其顏色不得更深。51整理課件4.青霉素鈉〔鉀〕的吸收度檢查：供試液1.80mg/ml，

結(jié)果判斷：A280不得大于0.1052整理課件〔一〕高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保存行為的不同而實現(xiàn)高效別離，并與標(biāo)準(zhǔn)品相對照，而對其進(jìn)行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件〔1〕Column-CNODSC18C8-Ben〔2〕mobilephase/flowrate〔3〕columntemperature〔4〕detectionwavelength〔5〕workstationsamplepreparation四、含量測定-容量法和儀器分析法53整理課件實驗本卷須知〔1〕色譜峰要到達(dá)較好的別離－基線別離(baseseparation)〔2〕需要標(biāo)準(zhǔn)品對照，用外標(biāo)法定量〔3〕可同時測定多個組分的含量〔4〕需要排除制劑中輔料等雜質(zhì)對測定的干擾54整理課件〔二〕生物樣本中β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析血漿尿樣唾液膽汁生物樣本色譜柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)樣品制備：取血漿200μL，參加內(nèi)標(biāo)5μL，再參加HCLO4，窩旋提取InternalstandardIS55整理課件56整理課件第三節(jié)氨基糖苷類抗生素57整理課件第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素58整理課件鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺59整理課件鏈霉素：鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺60整理課件巴龍霉素D-葡萄糖胺+脫氧鏈霉胺+D-核糖+巴龍霉糖巴龍胺苷元巴龍二糖胺糖61整理課件慶大霉素糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺糖62整理課件絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺63整理課件慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3慶大霉素C1aR、R1、R2=H慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH364整理課件一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素3個慶大霉素5個堿性中心堿性〔一〕水溶性溶解性（二）65整理課件鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）66整理課件坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)67整理課件二、

鑒別

茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)68整理課件〔2〕Molisch反響具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸作用下脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，參加α–萘酚〔紅紫色〕或蒽酮〔藍(lán)紫色〕69整理課件紅紫色70整理課件〔3〕Elson-Morgan反響水解產(chǎn)生的N-甲基-L-葡萄糖胺在堿性溶液中與乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反響，生成櫻桃紅色縮合物。藍(lán)紫色71整理課件〔4〕麥芽酚反響－鏈霉素的特征反響鏈霉素水解得到的鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍，生成α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮〔麥芽酚〕，該化合物與Fe3+在弱酸性溶液中形成紅紫色配位化合物。72整理課件紫紅麥芽酚73整理課件〔5〕坂口反響－鏈霉胍的特有反響向鏈霉素的水解產(chǎn)物鏈霉胍與NaBrO2反響得產(chǎn)物1；8-羥基喹啉也和NaBrO2反響得產(chǎn)物2。產(chǎn)物1和產(chǎn)物2再相互作用生成橙紅色化合物。74整理課件〔八〕色譜法〔1〕TLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

點樣：供試液：展開、涼干、碘蒸氣中顯色

對照液

判斷：供試液與對照液所顯斑點的顏色與位置應(yīng)一致。

點樣：供試液

對照液①：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品

對照液②：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品+硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品+硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品

75整理課件判定法：供試液中主斑點的位置、顏色、大小應(yīng)與對照液①相同，

對照液②應(yīng)顯示別離清晰的3個斑點否那么試驗無效。

〔2〕HPLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

比較供試液與對照液各組分的保存時間。76整理課件特殊雜質(zhì)的檢查〔1〕鏈霉素中鏈霉素B的檢查－TLC法硅膠G板〔使用前需活化〕、展開劑甲苯-冰乙酸-甲醇〔50:25:25〕、0.2％二羥萘的乙醇－20％硫酸混合液〔2〕慶大霉素中組分C的檢查－衍生化后HPLC色譜柱、流動相、檢測波長、衍生化條件的摸索組分C的毒副作用和耐藥性與慶大霉素有差異，導(dǎo)致產(chǎn)品的效價和臨床療效77整理課件++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.78整理課件1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物79整理課件RP－HPLC方法

2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算

3.峰面積歸一化法80整理課件81整理課件四、

含量測定微生物檢定法各國藥典主要采用HPLC法常用于體內(nèi)藥分

返回82整理課件第四局部：四環(huán)素類抗生素TrtracyclinesTC83整理課件理化特性〔1〕酸堿兩性－C4〔二甲氨基〕、C10〔酚羥基〕〔2〕旋光性－含有手性中心〔一般為左旋〕〔3〕紫外吸收特性－具有共軛雙鍵體系〔吸收波長為長波方向〕〔4〕與金屬離子的配位化合物反響－酚羥基和烯醇基〔5〕不穩(wěn)定性－對各種外界條件，包括氧化劑、酸、堿，易形成差向、脫水和異四環(huán)素，顏色加深84整理課件弱酸性環(huán)境ETC差向四環(huán)素85整理課件強(qiáng)酸性環(huán)境ATC脫水四環(huán)素86整理課件堿性環(huán)境EATC異四環(huán)素差向脫水四環(huán)素87整理課件二、

鑒別試驗

濃H2SO4反應(yīng)（一）黃色朱紅色綠藍(lán)深紫色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素42SOH鹽酸美他環(huán)素橙紅色88整理課件FeCl3反應(yīng)（二）褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素3FeCl89整理課件TLC法（三）鹽酸土霉素的鑒別

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象比較保存時間90整理課件三、

特殊雜質(zhì)檢查·4-差向四環(huán)素〔ETC〕·脫水四環(huán)素〔ATC〕·差向脫水四環(huán)素〔EATC〕·鹽酸金霉素〔CTC〕有關(guān)物質(zhì)（一）HPLC法〔2000版〕鹽酸四環(huán)素91整理課件四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％92整理課件吸收度（二）nmmax355268l、鹽酸四環(huán)素93整理課件雜質(zhì)吸收度

取供試品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測定，其吸收度不得超過0.12。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時間94整理課件四、

含量測定HPLC法鹽酸四環(huán)素的測定

系統(tǒng)適用性試驗：鹽酸四環(huán)素、有關(guān)物質(zhì)及ATC峰間的別離度均應(yīng)符合要求。

定量方法：外標(biāo)法以峰面積計。

95整理課件第五節(jié)抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)的檢查1.高分子雜質(zhì)分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱。96整理課件

蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。

藥物的自身聚合物，來自于生產(chǎn)、貯存過程?？梢l(fā)過敏。

外源性雜質(zhì)內(nèi)源性雜質(zhì)97整理課件2、根本特點－對青霉素而言青霉噻唑多肽－外源性的〔2400～3500〕青霉素聚合物－內(nèi)源性的〔聚合度〕母核參與的聚合反響－N型聚合反響側(cè)鏈參與的聚合反響－L型聚合反響分類98整理課件〔1〕生產(chǎn)過程中的任何蛋白或碎片都可帶入產(chǎn)品中，易與藥物形成多肽類雜質(zhì)〔2〕形成的聚合物也可發(fā)生不同程度的降解〔3〕異構(gòu)體之間可以相互聚合－L-L、D-D、L-D〔4〕高分子雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝密切相關(guān)特點99整理課件高分子雜質(zhì)的控制方法〔1〕高效液相色譜法〔2〕凝膠色譜