毒理學(xué)第五講-生殖毒理學(xué)要點(diǎn)

外源化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性及其評價(jià)9/16/20191第一節(jié)

概

述9/16/20192哺乳動物的生育繁殖過程外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響以及損害作用的特點(diǎn)哺乳動物的生育繁殖過程9/16/20193生殖發(fā)育是哺乳動物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細(xì)胞發(fā)生，即精子發(fā)生和卵細(xì)胞發(fā)生、配子的釋放、性周期胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、

胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。述和性行為、卵細(xì)胞受精、受精卵的卵裂、連續(xù)、完整的生殖發(fā)育過程的六個(gè)階段A.從交配前到受孕：檢查成年雄性生殖功能、配子的發(fā)育與成熟，交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成年雌性生殖功能、胚胎著床前發(fā)育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、胚體發(fā)育、主要器官形成。D.從硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胎體的發(fā)育與生長、器官的發(fā)育與生長。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對宮外生活的適應(yīng)性、斷乳前的發(fā)育與生長。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長、對獨(dú)立生活的適應(yīng)、達(dá)到完全的性功能。9/16/20194外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響9/16/20195干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程。外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的特點(diǎn)9/16/20196生殖發(fā)育過程較機(jī)體其他系統(tǒng)更為敏感；外源化學(xué)物對生殖發(fā)育過程影響的范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)。不僅直接涉及雌雄兩個(gè)個(gè)體，同時(shí)還可以在其第二代個(gè)體表現(xiàn)出損害作用，而且

此種損害甚至在第二代以后的個(gè)體中表現(xiàn)出來。第二節(jié)

生殖毒性及其評定9/16/20197生殖毒理學(xué)歷史生殖毒性生殖毒性的評價(jià)生殖毒理學(xué)歷史9/16/201981950年美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形。1956年用于治療妊娠反應(yīng)的反應(yīng)停，1961年后出現(xiàn)近萬例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成的大面積污染及其與人群生殖危害的關(guān)系至今仍不清楚。生殖毒理學(xué)歷史9/16/20199過去半個(gè)世紀(jì)震驚全球的系列中毒或?yàn)?zāi)難事件的發(fā)生，在世界范圍內(nèi)提高了人們對用藥的安全意識，高度關(guān)注新的化學(xué)物對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)或妊娠結(jié)局的不良影響，促進(jìn)了與生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)安全相關(guān)法律的產(chǎn)生和研究方法指南的問世。生殖毒性表現(xiàn)9/16/201910外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調(diào)或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。對雄性生殖系統(tǒng)的毒作用對睪丸的毒性的有害作用精子生成障礙性欲異常，喪失生育能力引起生殖細(xì)胞突變，造成可遺傳損害直接損傷睪丸中的細(xì)胞群繼發(fā)性的影響精子發(fā)生對精子發(fā)改生變下丘腦-垂體功能直接影響睪丸細(xì)胞功能9/16/201911對雌性生殖系統(tǒng)的毒作用生殖道的損害：影響運(yùn)送卵子/受精/受精卵發(fā)育對下丘腦-垂體系統(tǒng)的損害：閉經(jīng)，受孕力降低對卵巢的損害生長卵泡和成熟卵泡降低，排9/16/201912卵母細(xì)胞數(shù)下降/突變卵抑制，受孕力下降干擾卵巢內(nèi)分泌，影響受精/著床/胚胎發(fā)育評定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。是檢查外源化學(xué)物對動物生育繁殖機(jī)能有無損害作用的試驗(yàn)。9/16/201913生殖毒性的評價(jià)主要是根據(jù)發(fā)育階段的區(qū)別來設(shè)計(jì)的，每一段試驗(yàn)大致相當(dāng)于上述兩個(gè)階段。I段：生育能力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（一般生殖毒性試驗(yàn)，主要反映妊娠前及妊娠初期的情況）II段：胚體—胎體毒性試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)）III段：出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)（圍生期毒性試驗(yàn)，反映外源化合物對胚胎發(fā)育后期、母代分娩過程、哺乳期的影響）9/16/201914三階段生殖毒性試驗(yàn)?zāi)康模涸u價(jià)受試物對配子成熟、交配行為、生育力、胚胎著床的影響（前述生殖周期的A和B階段）。給藥期：雄性從交配前4周開始染毒，并持續(xù)至交配成功；雌性交配前2周開始染毒（以覆蓋3~4個(gè)動情周期）至妊娠第6天受精卵著床。9/16/201915I段：生育能力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（一般生殖毒性試驗(yàn)）Ⅱ段：肧體-胎體毒性試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)）9/16/201916目的：評價(jià)自胚泡著床到硬腭閉合階段暴露受試物對妊娠母體和胚胎與胎仔發(fā)育的有害效應(yīng)。包括母體毒性、胚胎或胎兒死亡、生長改變和結(jié)構(gòu)異常。給藥期：為著床期到硬腭閉合，即器官形成期；大、小鼠為受孕第6~15天，家兔為第6~18天。Ⅲ段：出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)（圍生期毒性試驗(yàn)）9/16/201917目的：評價(jià)母體從著床至斷乳期間接觸受試物對妊娠/哺乳母體和對胎仔及仔代直至性成熟的有害效應(yīng)。給藥期：著床期開始，至仔鼠斷乳。大鼠孕15天至產(chǎn)后28天?！な茉噭游铮憾嘤眯猿墒齑笫?，也可用小鼠或家兔·劑量分組:一般設(shè)立三個(gè)劑量組和兩個(gè)對照組高劑量組產(chǎn)生輕微毒性癥狀，但其死亡率不大于10%，也不能完全喪失生育能力。相當(dāng)于1/10LD50

。低劑量組則不應(yīng)產(chǎn)生任何可觀察到的損害效應(yīng)。相當(dāng)于高劑量組的1/30。9/16/201918?中劑量組應(yīng)僅能出現(xiàn)極為輕微的中毒癥狀。如果1000mg/kg體重劑量對生育能力無損害作用，或最高劑量可引起親代動物表現(xiàn)一般毒性作用，但對生育力無不利影響，則可不進(jìn)行其它劑量試驗(yàn)。一、一般生殖毒性實(shí)驗(yàn)方法原則·染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實(shí)際接觸途徑9/16/201919?交配前雄性動物應(yīng)染毒4-10周，雌性動物2周一般可混入飼料或飲水中，也可采用灌胃或膠囊法?！游铮褐辽俨捎靡环N動物，

推薦用大鼠；每組雌雄各20只；雌性動物妊娠13-15天處死，雄性交配成功處死。一、一般生殖毒性實(shí)驗(yàn)方法原則1.雄性生殖毒性評價(jià)動物實(shí)驗(yàn)精子生成分析（精子計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)及存活率）精子功能檢測睪丸標(biāo)志酶活性檢測交配實(shí)驗(yàn)顯性致死試驗(yàn)9/16/201920評價(jià)方法9/16/201921小鼠精子頭部是鉤狀！9/16/2019229/16/201923三代兩窩F０（斷奶或出生８周）2.雌性生殖毒性的評價(jià)F３bF３aF２b給予受試物８到１２周第一次交配第二次交配F１a觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況F１b斷乳后給予受試物８到１２周F２a觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長發(fā)育情況斷乳后給予受試物８到１２周9/16/201924兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗(yàn)出生第８周給予受試物（F０）第16-19周

雌雄交配F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）斷奶，給予受試物F１交配F２出生，每窩留８只幼仔F２斷奶，檢查發(fā)育情況9/16/201925·受孕率（％）:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況·正常分娩率（％）:反映雌性動物妊娠過程是否受到影響·幼仔出生存活率（％）:反映雌性動物分娩過程是否正?！び^察指標(biāo)：9/16/201926·幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力·除上述４個(gè)指標(biāo)外，還應(yīng)該注意出生幼仔是否有畸形存在，對死亡的幼仔應(yīng)進(jìn)行畸形檢查，可為下一步致畸試驗(yàn)提供參考·觀察指標(biāo)：9/16/201927基本概念致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)致畸作用機(jī)理外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價(jià)9/16/201928第三節(jié)

發(fā)育毒性及其評定生殖是對親代動物而言，從配子生成、受精到胎體分娩是一生殖過程。發(fā)育主要是對子代而言，從受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都屬于發(fā)育過程。發(fā)育毒性也成為胚胎毒性。9/16/201929發(fā)育毒理學(xué)的發(fā)展簡史畸胎學(xué)（古代）現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)（19世紀(jì)）發(fā)育毒理學(xué)9/16/201930畸胎學(xué)（古代）畸胎學(xué)是發(fā)育毒理學(xué)的基礎(chǔ)?；W(xué)作為一門描述性科學(xué)在文字之前就已經(jīng)存在了，四大文明古國都有畸胎的記載。最早可以追溯到公元前6500年土耳其的聯(lián)體嬰兒石刻。5000年前埃及壁畫所描述的唇腭裂和軟骨發(fā)育不全等。當(dāng)時(shí)人們相信出生異常的嬰兒是上天的懲罰、星象的反應(yīng)和未來的預(yù)兆，有的則以為是人和動物之間雜交的結(jié)果。隨著16~17世紀(jì)生物科學(xué)的發(fā)展，才逐漸對畸胎有了科學(xué)的認(rèn)識。WilliamHarvey于1651年提出了發(fā)育受阻學(xué)說，認(rèn)為畸形起因于器官或結(jié)構(gòu)的不完全發(fā)育。9/16/201931現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)（19世紀(jì)）現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)始于19世紀(jì)初，當(dāng)時(shí)的胚胎學(xué)家使用各種物理因素（震動、倒置、針刺）和化學(xué)毒物處理雞蛋，產(chǎn)生了畸形小雞，有神經(jīng)管缺陷、無腦、脊柱裂、獨(dú)眼、心臟缺陷、位置顛倒和聯(lián)體雙胞胎等。他們還注意到作用時(shí)間在決定畸形類型方面比損傷的性質(zhì)更為重要。9/16/20193220世紀(jì)早期20世紀(jì)早期發(fā)現(xiàn)多種環(huán)境因素（溫度、微生物毒素、藥物）可以干擾鳥、爬蟲類、魚和兩棲類的發(fā)育。開始人們以為哺乳動物胚胎對致畸因子具有耐受性，要么直接致死，要么受母體的保護(hù)，對胚胎沒什么影響。1935年，Hale首次報(bào)道維生素A缺乏誘導(dǎo)母豬產(chǎn)下突眼和腭裂的畸形后代。此后又有一些研究發(fā)現(xiàn)母體營養(yǎng)缺乏和許多環(huán)境因素，如氮芥、錐藍(lán)、激素、抗代謝藥、烷化劑、缺氧和X射線等可以引起哺乳動物畸形。9/16/201933重大歷史事件9/16/201934是研究發(fā)育中的生物體從受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期間，由于暴露于外源性理化因素而產(chǎn)生的各種發(fā)育異常及其機(jī)制，為理化因素的危險(xiǎn)度或安全性評價(jià)和預(yù)防措施提供依據(jù)的一門學(xué)科。9/16/201935發(fā)育毒理學(xué)developmental

toxicology基本概念1.

發(fā)育毒性(developmental

toxicity)指出生前經(jīng)父體和(或)母體接觸外源性理化因素引起的在子代到達(dá)成體之前出現(xiàn)的有害作用。具體表現(xiàn)可分為:·生長遲緩:

即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外源化學(xué)物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢?！ぶ禄饔?

由于外源化學(xué)物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時(shí)，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常?！すδ懿蝗虍惓?

即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常?！づ咛ニ劳?

某些外源化學(xué)物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。9/16/2019362.

畸形、畸胎和致畸物·畸形(malformation):器官形態(tài)的異常?！ぶ禄锘蛑禄?teratogen):凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物?！せ?terate):具有畸形的胚胎或胎仔?！ぶ禄囼?yàn):評定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗(yàn)。9/16/201937基本概念胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化學(xué)物引起的胎仔生長發(fā)育遲緩和功能缺陷不全的損害作用，對母體無顯著的毒效應(yīng)。（其中不包括致畸和胚胎致死作用。）母體毒性作用(maternal

toxicity)母體毒性作用是指外源化學(xué)物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。9/16/201938基本概念母體毒性作用與致畸作用關(guān)系·具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)?！こ霈F(xiàn)致畸作用的同時(shí)也表現(xiàn)母體毒性。·不具有特定致畸作用機(jī)理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)?！H具有母體毒性，但不具有致畸作用?！ぴ谝欢▌┝肯?，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。9/16/2019395.畸形與變異·在胚胎或胎兒出現(xiàn)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為畸形?！C(jī)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代之間或子代的個(gè)體之間，有時(shí)出現(xiàn)不完全相同的現(xiàn)象，即為變異。9/16/201940基本概念致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)9/16/201941器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感劑量與效應(yīng)關(guān)系較為復(fù)雜·劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因在一定范圍內(nèi)，畸胎率與劑量成正比，當(dāng)高到一定水平引起胚胎死亡而掩蓋了致畸作用，畸胎率反而會下降?！ぶ禄饔玫膭┝糠磻?yīng)曲線較為陡峭，斜率很大致畸帶：從無作用劑量到胚胎死亡劑量的范圍種屬差異以及個(gè)體差異在致畸作用中較為明顯·在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。·種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。9/16/201942致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)致畸作用機(jī)理9/16/201943Wilsom(1977)提出了畸形發(fā)生的9種機(jī)制，包括突變、染色體斷裂、有絲分裂改變、改變

核

酸完整性或功能、減少前體或底物的補(bǔ)給、減少能源支持、改變膜特性、滲透壓不平衡和酶抑制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進(jìn)展，雖然胚胎有代償機(jī)制彌補(bǔ)外源性化學(xué)物的影響，但是，是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個(gè)步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。二、Wilson發(fā)育毒理學(xué)基本原理（一）對致畸的易感性取決于孕體的基因型及其與有害環(huán)境因子相互作用的方式。（二）對致畸的易感性隨著對有害因素暴露的發(fā)育時(shí)期的不同而變化。（三）致畸物以特異的方式（作用機(jī)制）作用于發(fā)育的細(xì)胞和組織，啟動一系列的異常發(fā)育事件（細(xì)胞病理機(jī)制）。（四）有害影響能否接近發(fā)育中的組織取決于有害影響本身的性質(zhì)。（五）異常發(fā)育的四種表型是：死亡、畸形、生長遲緩和功能缺陷。（六）隨著劑量的增加，異常發(fā)育表型的頻率和程度也隨之增加，從無毒作用到全部致死。9/16/201944基因突變引起胚胎發(fā)育異常細(xì)胞死亡和增殖速度減慢細(xì)胞間通訊抑制胚胎中間代謝障礙胚胎組織中發(fā)育過程的不協(xié)調(diào)9/16/201945致畸作用機(jī)制外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價(jià)9/16/201946傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)·動物選擇·劑量分組·動物交配處理·胎仔檢查主要試驗(yàn)方案：三段生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)藥物的生殖發(fā)育毒性。一代和多帶生殖毒性試驗(yàn)主要用于評價(jià)食品添加劑、農(nóng)藥及其他化學(xué)物的生殖發(fā)育毒性。由美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）首先提出。改進(jìn)的大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性的試驗(yàn)程序。9/16/201947外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評價(jià)傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)9/16/201948·動物選擇·劑量分組·動物交配處理·胎仔檢查·動物選擇:9/16/201949致畸試驗(yàn)的動物選擇，除參照毒性試驗(yàn)中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價(jià)廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點(diǎn)。通常采用兩種動物：一種嚙齒類，首選大鼠；另一種非嚙齒類推薦家兔?！┝糠纸M9/16/201950一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設(shè)3個(gè)劑量組，另設(shè)對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑

量可為1／100～1／30?！そo藥期9/16/201951在胚胎器官形成期連續(xù)給藥（由胚胎著床到硬腭閉合），大鼠孕后6-15天，家兔6-18天。由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動物接觸受試物的時(shí)間，必須在器官發(fā)生器?！游锝慌涮幚?/16/201952每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1

日?！ぬプ袡z查9/16/201953自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。活胎、早起死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚起死亡胚胎的鑒別方法：（1）活胎：胚胎已完整成形，色鮮紅，有自然運(yùn)動，機(jī)械刺激后有運(yùn)動反應(yīng)。（2）早期死亡的胚胎：胚胎的大小、外形和色澤可因死亡時(shí)間的相對遲早及死后自溶時(shí)間的長短變化很大，一般胎盤較小或不明顯，胎盤形體較小，外形不完整，各部位發(fā)育尚未完全，呈紫紅色，無自然動作。（3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明顯胎盤，但色澤灰暗，無光澤，無自然運(yùn)動，機(jī)械刺激后無運(yùn)動反應(yīng)。9/16/201954下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：·外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；·肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；·骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。9/16/201955·結(jié)果評定9/16/201956·活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù):