六種方法測定蛋白質(zhì)含量

常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。以下引用：6種方法測定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏〔kjeldahl〕定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨〔消化〕，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，依據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。假設(shè)以甘氨酸為例，其反響式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3(1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4(2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3(3)反響〔1〕、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反響〔3〕在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)展。為了加速消化，可以參與cuso4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。試驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。二、雙縮脲法〔biuret法〕〔一〕試驗(yàn)原理雙縮脲〔nh3conhconh3〕是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反響。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反響。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要格外準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)測定。〔二〕試劑與器材試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白〔bsa〕或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa1mg/mla2800.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再依據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血h2o0.9%nacl0．05nnaoh配制。雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅〔cuso4?5h2o〕和6.0克酒石酸鉀鈉〔knac4h4o6?4h2o〕，50030010%naoh1升，貯存于塑料瓶中〔或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中〕。此試劑可長期保存。假設(shè)貯存瓶中有黑色沉淀消滅，則需要重配制。器材：15支、旋渦混合器等。〔三〕操作方法1.120，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)14毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫〔20～25℃〕下放置30540nm處進(jìn)展比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白比照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸取值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。留意樣品濃度不10mg/ml。三、folin—酚試劑法〔lowry法〕〔一〕試驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難〔現(xiàn)在已可以訂購〕，近年來漸漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是一樣的，只是參與了其次種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反響產(chǎn)生深蘭色的緣由是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基復(fù)原，產(chǎn)生深蘭色〔鉬蘭和鎢蘭的混合物〕。在確定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。folin—lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的根本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反響發(fā)生干擾的離子，同lowry反響。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素〔0.5%〕，硫酸納〔1%〕，硝酸納〔1%〕，三氯乙酸〔0.5%〕，乙醇〔5%〕，乙醚〔5%〕，丙酮〔0.5%〕等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必需作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測定。假設(shè)樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必需提高碳酸鈉—1～2倍。folin—ph條件下穩(wěn)定，但上述復(fù)原反響ph=10folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時，必需馬上混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，復(fù)原反響即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg?！捕吃噭┡c器材試劑試劑甲：〔a〕10克na2co3，2克naoh0.25克酒石酸鉀鈉〔knac4h4o6?4h2o〕。溶解于500毫升蒸餾水中。100501〔b〕混合，即為試劑甲。2100〔o,25〔na2moo4?2h2o〕7005085%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10150克硫酸鋰〔li2so4〕，50毫升蒸餾水及數(shù)滴15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色〔如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟〕1naoh滴定，酚酞11n左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:準(zhǔn)確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g—250mg/ml0.9%nacl溶液。器材可見光分光光度計(jì)旋渦混合器秒表16支〔三〕操作方法16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液〔濃度為250mg/ml〕1.0毫升5毫升試劑甲，在旋渦混合器上快速混合，于室溫〔20～25℃〕10分鐘。再0.5毫升試劑乙〔folin—酚試劑〕，同樣馬上混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度30700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。lowry反響的顯色隨時間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必需準(zhǔn)確把握時間，即第15毫升試劑甲后，開頭計(jì)時，125毫升試劑甲，23支試管，余此1010.5毫升試劑乙，1分鐘20.5毫升試劑乙，23再放置30分鐘，然后開頭測定光吸取。每分鐘測一個樣品。進(jìn)展多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必需在試驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要參與的量〔毫升〕，并按由左至右，由上至下的挨次，逐管參與。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量〔微克〕和測得的吸光度值。folin—酚試劑法試驗(yàn)表管號12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.10.20.40.60.81.0〔250mg/ml〕未知蛋白質(zhì)0.20.40.6〔250mg/ml〕蒸餾水 1.00.90.80.60.40.2 00.80.60.4試劑甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0試劑乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白質(zhì)的量〔mg〕吸光度值〔a700〕1毫升樣品溶液〔20~250微克〕，按上述方法進(jìn)展操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白比照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時進(jìn)展。即38、9、10試管。依據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。留意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度〔相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)〕。四、改進(jìn)的簡易folin—酚試劑法〔一〕試劑1.0.5nnaoh、10%na2co3、0.1%0.05%硫酸銅，配制時留意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最終參與。2.試劑乙：與前面的根本法一樣。臨用時加蒸餾水8倍。3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同根本法?！捕巢僮鞑襟E110分鐘后，4555660nm下測定其吸光度值。改進(jìn)的快速簡易法，可獲得與folin—酚試劑法〔lowry根本法〕相接近的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法〔bradford法〕〔一〕試驗(yàn)原理雙縮脲法〔biuret法〕folin—酚試劑法〔lowry法〕的明顯缺點(diǎn)和很多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ゲ檎腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法〔bradford法〕，是依據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)爭論認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸〔特別是精氨酸〕和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。595nma595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：lowry1mg。這是由于蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸取值隨蛋白質(zhì)濃度lowry法要大的多。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋21520分lowry法那樣費(fèi)時和嚴(yán)格地把握時間。lowryk+、na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。此法的缺點(diǎn)是：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以削減這方面的偏差。tritonx-100〔sds〕0.1nnaoh?！?.1nlowary法一樣〕。標(biāo)準(zhǔn)曲線也有略微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)展計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度?！捕吃噭┡c器材試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)1.0mg/ml0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液?？捡R斯亮蘭g—250100mgg—25050ml95%的乙醇后，再參與120ml85%1升。器材：可見光分光光度計(jì)旋渦混合器16支〔三〕操作方法標(biāo)準(zhǔn)方法取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中挨次，分別參與樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別參與：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml0.1ml5.0mlg—250試劑，每加完一管，馬上在旋渦混合器上混合〔留意不要太猛烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消退〕。未知樣品的8、9、10管。加完試劑2-5分鐘后，即可開頭用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸取值a59510.1mlh2o5.0mlg—250試劑。留意：不行使用石英比色皿〔因不易洗去染色〕，可用塑料或玻璃比色皿，使用后馬上用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不行用乙醇或丙酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法試驗(yàn)表管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.080.10(1.0mg/ml)未知蛋白質(zhì)0.020.040.06(1.0mg/ml)蒸餾水 0.10.090.080.060.040.02 0 0.080.060.04考馬斯亮藍(lán)g－250試劑5.0 5.0 5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋白質(zhì)量〔mg〕光吸取值〔a595〕用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量〔mg〕為橫座標(biāo)，用吸光度值a595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。a595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/mla5950.50。微量法〔10－100mg/ml〕,〔包括補(bǔ)加的水0.5ml1.0ml,空0.5ml1.0mlh2o,g－2505.0ml,同時作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，595nm的光吸取值。0.05mg牛血清蛋白/mla5950.29。六、紫外吸取法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸取紫外光的性280nm〔即光密度值238nm的光吸取值與肽鍵含量成正比。利用確定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸取值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)展蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸取法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的〔nh4〕2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，由于此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其確定值。此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有確定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相像的蛋白質(zhì)。假設(shè)樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸取紫外光的物質(zhì)，會消滅較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)展計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是由于不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸取是不一樣的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在確定的誤差。此外，進(jìn)展紫外吸取法測定時，由于蛋白質(zhì)吸取頂峰常因ph的轉(zhuǎn)變而有變化，因此要留意溶液的phphph相全都。下面介紹四種紫外吸取法：280nm的光吸取法280nm處具有最大吸取，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸取法?！菜蚓彌_液作空白比照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可把握在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，a280約為1.0左右。由此可馬上計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。很多蛋白質(zhì)在確定濃度和確定波長下的光吸取值〔a1％1cm〕有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，依據(jù)此光吸取值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與〔a1％1cm〕值〔即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光1cm時的光吸取值〕a1％1cm,?稱為百分吸取系數(shù)或比吸取系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=(a280′10)/a1cm,280nm(q1%濃度?10mg/ml)a1％1cm=6.3(280nm)溶菌酶： a1％1cm=22.8(280nm)a1％1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白〔bsa〕。6支試管，按下表編號并參與試劑：管號 1 2 3 4 5 6bsa〔1.0mg/ml〕01.02.03.04.05.0h2o 5.04.03.02.01.00a2801a280a280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量〔mg〕為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)測a28026a280值與相應(yīng)的試a1％1cm,280nm280nm260nm的吸取差法280nm10倍〔每克〕，260nm處的260nm260nm280nm2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm260nm