分枝桿菌電轉(zhuǎn)化方案

1分枝桿菌電轉(zhuǎn)化分為慢速生長型分枝桿菌(如TiceBCG/M.M/H37Ra/H37Rv菌等)及快速生長型分枝桿菌(M.smegmatice菌等)。Scheme：慢速生長型分枝桿菌電轉(zhuǎn)程序：[留意：也可以承受菌落轉(zhuǎn)化：取穎的菌落，約兩滿板，刮到含有玻璃5X5min10%甘3遍，其余同下面的轉(zhuǎn)化。]需要預(yù)備的材料：1)10%甘油+0.05%Tween80[20ml甘油+180+100ulTween80，并0.2μm1滅菌的玻璃珠，50mlBio-rad于0.2cm25-ml移液管。50mlOD0.5-1.01ml槍尖。程序：將待轉(zhuǎn)菌接種50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中，37〔對M.marinum，M.ulcerans28-30。5ml50ml離心管復(fù)壯，待長起之后，需取>2ml50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中；50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐104510ml50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中。]檢測菌液的OD0.5-1.2，則可進(jìn)展電轉(zhuǎn)化。10%甘油+0.05%Tween800.2μm40ml50mL10~1354000-8000rpm5參加40mL10%4000-8000rpm55〕1-21mL腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞密度]，用帶濾芯的槍尖，吹吸均勻后，室溫靜置萬留意：槍桿不要遇到管壁。]0.2cm10μL濃縮后的質(zhì)粒DNA和200μL3710DNABio-radGenePulser2.5KV1000、電容25μFDNA19~21該時(shí)間范圍顯示待轉(zhuǎn)細(xì)菌處于良好狀態(tài)未發(fā)生爆炸的電轉(zhuǎn)杯滅菌后仍舊可用?？焖儆脦V芯的槍尖于電轉(zhuǎn)液中參加2mL7H9801mL1mL50mL留意：槍桿不要遇到管壁。]3712~20用帶濾芯的槍尖吹吸混勻后，1ml/1.5mltube分裝，10000rpm離心10.6mL7H9500μL/板7H114-anti*及相應(yīng)抗生素)培育板中。同時(shí)稀釋一百倍后，500μL/板鋪板。[可以嘗試制備的感受態(tài)于-80驗(yàn)]避光，于372放在一起，造成連環(huán)污染]。每周觀看污染狀況，第一周后，平板倒置。觀看時(shí)，不要翻開塑料袋。第4留意：離心要配平。備注1:4-anti抗生素:多粘菌素B、放線菌酮、羧芐西林及甲氧芐啶，終濃200、50、5020μg/mL)。BCG，H37RvandH37Ra7H9可以加:4-anti快速生長型電轉(zhuǎn)程序：需要預(yù)備的材料：1)10%甘油+0.05%Tween80[20ml甘油+180毫升水+100ulTween800.2μm1滅菌的玻璃珠，50ml離心管，Bio-rad于0.2cm的電轉(zhuǎn)杯，25-ml移液管。50mlOD0.6-1.3]。帶濾芯的1ml程序：將待轉(zhuǎn)菌接種50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中，375ml50ml離心管復(fù)壯，待長起之后，需取>2ml50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中；50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐10415ml50mL7H90.1%tween80)的液體培育基的錐形瓶中。]檢測菌液的OD0.6-1.3，則可進(jìn)展電轉(zhuǎn)化。10%甘油+0.05%Tween800.2μm40ml50mL10~13充分渦旋54度離心機(jī)中4000-8000rpm5-10參加40mL10%甘油，于渦旋器中充分洗滌細(xì)菌后，于4度離心機(jī)中以4000-8000rpm55〕1-21mL[千萬留意：槍桿不要遇到管壁。]0.2cm10μL濃縮后的質(zhì)粒DNA200μL10電轉(zhuǎn)儀前擦盡電轉(zhuǎn)杯上的水分，Bio-radGenePulser2.5KV1000、電容25μFDNA19~21該時(shí)間范圍顯示待轉(zhuǎn)細(xì)菌處于良好狀態(tài)未發(fā)生爆炸的電轉(zhuǎn)杯滅菌后仍舊可用?？焖儆脦V芯的槍尖于電轉(zhuǎn)液中參加2mL7H9801mL1mL50mL留意：槍桿不要遇到管壁。]374~12用帶濾芯的槍尖吹吸混勻后，1ml/1.5mltube分裝，10000rpm離心10.6mL7H9500μL/板鋪于7H11(不含4-anti*)含相應(yīng)抗生素[40ug/mlHYGor25ug/mlKAN]培育板中。同時(shí)稀釋一百倍后，500μL/板鋪板。[可以嘗試制備的感受態(tài)于-80372放在一起，造成連環(huán)污染]