微生物學(xué)-武漢輕工大學(xué)虛擬仿真教學(xué)中心課件

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院課程組人員:繆禮鴻胡申才代江紅周幗萍曾馳制作人員:胡申才一、課程簡(jiǎn)介

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是微生物學(xué)課程教學(xué)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本課程總計(jì)48學(xué)時(shí)，使用教材是沈萍主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（第三版）。通過本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解微生物學(xué)的基本知識(shí)；鞏固和加深所學(xué)理論知識(shí)；掌握微生物學(xué)最基本的操作技能。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考和理論聯(lián)系實(shí)際能力；養(yǎng)成實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度，以及敢于創(chuàng)新的開拓精神；并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步提高學(xué)生的科學(xué)素質(zhì)修養(yǎng)。二、微生物與實(shí)際應(yīng)用微生物與發(fā)酵工程微生物與環(huán)境工程微生物與農(nóng)業(yè)微生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域微生物與食品工業(yè)三、微生物學(xué)與Nobel獎(jiǎng)

到目前為止，幾十項(xiàng)Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)都與微生物學(xué)有關(guān)參考：沈萍教授《微生物學(xué)》緒論部分

Nobel獲獎(jiǎng)?wù)呷珪摹⑷绾芜M(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)肅認(rèn)真科學(xué)態(tài)度分析問題搞清原理五、微生物實(shí)驗(yàn)安排與考核基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：80%，12次，一次考試自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：20%

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)操作總結(jié)匯報(bào)課堂紀(jì)律嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度嚴(yán)肅課堂紀(jì)律不允許無故曠課、早退（1次）遲到（3次）工作服實(shí)驗(yàn)室安全和衛(wèi)生安全實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙。注意用水、防電和防火正確使用化學(xué)試劑和儀器衛(wèi)生每次實(shí)驗(yàn)需留下6位同學(xué)值日，協(xié)助保持實(shí)驗(yàn)室清潔實(shí)驗(yàn)一顯微鏡使用及簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)三莢膜與芽孢染色實(shí)驗(yàn)四放線菌和藍(lán)細(xì)菌的形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)五霉菌形態(tài)特征實(shí)驗(yàn)六酵母菌形態(tài)觀察、死活細(xì)胞鑒別及細(xì)胞大小測(cè)定實(shí)驗(yàn)七微生物的數(shù)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)八玻璃器皿的洗滌、包扎、滅菌及無菌操作臺(tái)的使用實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)九培養(yǎng)基的配制和滅菌實(shí)驗(yàn)十芽孢桿菌的分離純化及觀察實(shí)驗(yàn)十一抗稻瘟霉的芽孢桿菌的分離及篩選實(shí)驗(yàn)十二食品或水中大腸菌群的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)十三微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定實(shí)驗(yàn)十四細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)十五微生物菌種保藏技術(shù)顯微鏡概述微生物的個(gè)體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學(xué)研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解顯微鏡的種類、結(jié)構(gòu)、功能和正確地掌握不同顯微鏡的使用方法是很有必要的。

顯微鏡可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。光學(xué)顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡、微分干涉差顯微鏡、暗視野顯微鏡、紫外光顯微鏡、偏光顯微鏡和熒光顯微鏡。下面主要介紹普通光學(xué)顯微鏡。實(shí)驗(yàn)一顯微鏡使用及

微生物形態(tài)觀察一、目的要求1.學(xué)習(xí)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。2.學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法?；A(chǔ)知識(shí)尼康E-600顯微鏡

二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理1.普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(tái)(載物臺(tái))、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：增加照明亮度油鏡的放大倍數(shù)可達(dá)100x，教具很短，直徑很小，但所需要的光照強(qiáng)度卻最大。為了不使通過的光線有所損失，必須造又精于加入與玻璃的折射率（n=1.55）相仿的鏡油。通常用香柏油（n=1.52）.2.增加顯微鏡的分辨率油鏡的分辨率可達(dá)到0.2μm左右。2.顯微操作技術(shù)

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

顯微鏡的分辨率:也稱為分辨力，它是指能把兩個(gè)物點(diǎn)辨清的最小距離，分辨距離越大，則分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離來表示的。其計(jì)算公式為:D=0.61入/N·AN·A·=n·sina/2

式中D為分辨率，A為光波波長(zhǎng)，N·A·為物鏡的數(shù)值孔徑(鏡口率)。

在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，公式為:M=K1xK2

焦點(diǎn)深度:顯微鏡調(diào)焦到看清標(biāo)本某一點(diǎn)時(shí)，不僅是這一物點(diǎn)，而且它的上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點(diǎn)深度?？吹綐?biāo)本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細(xì)地從上到下進(jìn)行觀察。三、實(shí)驗(yàn)步驟

(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準(zhǔn)備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時(shí)要雙眼同時(shí)睜開，一邊觀察一邊進(jìn)行記錄或描繪。

(2)觀察時(shí)所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。

(3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個(gè)部件是否完整和正常，并對(duì)載物臺(tái)、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進(jìn)行必要的清潔工作。然后進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)2.顯微鏡的調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)旋鈕聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場(chǎng)光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標(biāo)本④聚光鏡升降旋鈕孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物操作步驟如下:(1）可變光欄的中心對(duì)準(zhǔn)聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，則裝配時(shí)已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整;如果可變光欄的水平位置可以移動(dòng)，則應(yīng)把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對(duì)準(zhǔn)聚光鏡下方的透鏡中心。

(2)載物臺(tái)上放置觀察標(biāo)本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺(tái)平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進(jìn)行調(diào)焦到能看見標(biāo)本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。

(3)轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標(biāo)本，然后去掉標(biāo)本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點(diǎn)是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點(diǎn)調(diào)到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。3.觀察操作(1)低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標(biāo)本移到視野中心，用細(xì)調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時(shí)，把所要進(jìn)一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時(shí)針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)焦，至看清物像。

（1）不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。（2）鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度（3）觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。（4）拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。（5）顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。4、顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)（二）簡(jiǎn)單染色1.定義

是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，不能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造，通常采用堿性染料（如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等）使其著色。Simplestains菌種：培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌（Escherichiacoli）

染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅染液、復(fù)紅、乙醚酒精溶液、香柏油、無菌水器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。2.實(shí)驗(yàn)器材1、簡(jiǎn)單染色3.實(shí)驗(yàn)方法：制片→染色→水洗→干燥→鏡檢（1）制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、自然干燥、加熱固定；注意無菌操作（2）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色1-2min。（3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（5）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。四、記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖五、思考題1.使用油鏡時(shí)，為使么選用香柏油或液體石蠟作為物鏡與玻片間的介質(zhì)？其他液體行嗎？2.油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過多的二甲苯或用酒精擦鏡有什么危害？3.什么是物鏡的同焦現(xiàn)象？他在顯微鏡觀察中有什么意義？4.觀察時(shí)為什么要用左眼，并且兩眼都應(yīng)睜開？（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）注意事項(xiàng)（六）實(shí)驗(yàn)作業(yè)實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌革蘭氏染色（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的操作技術(shù)；2、掌握細(xì)菌單染色和革蘭氏染色的方法；3、初步掌握無菌操作技術(shù)；4、掌握革蘭氏染色反應(yīng)原理、操作步驟和意義。1.革蘭氏染色法

是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法，因?yàn)橥ㄟ^此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及原理1234？結(jié)晶紫碘液酒精復(fù)紅革蘭氏染色的機(jī)理：

主要由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。1、菌種：培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌（Escherichiacoli）

2、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅染液、復(fù)紅、乙醚酒精溶液、香柏油、無菌水3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。（三）實(shí)驗(yàn)器材1、革蘭氏染色制片→初染（結(jié)晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脫色（乙醇20-30s）→水洗→復(fù)染（番紅2min）→水洗→干燥→觀察(四）實(shí)驗(yàn)方法：crystalvioletstainwashwithwater

Stainwithgram'siodinesolution

Decolorizebyadding95%alcohol

革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽性桿菌

CounterstainwithSafranin

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許乙醚-乙醇混合液將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。將顯微鏡小心輕拿，按號(hào)放入顯微鏡柜中。

②觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內(nèi)。（10）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理1、載玻片要潔凈無油跡。涂片時(shí)，滴水不要過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。2、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。？（五）注意事項(xiàng)3、染色過程中勿使染色液干涸。4、選用幼齡的細(xì)菌。（六）實(shí)驗(yàn)作業(yè)

繪出枯草桿菌和大腸桿菌的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。1．你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？

2．當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）注意事項(xiàng)（六）實(shí)驗(yàn)作業(yè)實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的芽孢和莢膜染色（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物標(biāo)本的制作方法；2、掌握芽孢、莢膜染色的基本原理及方法;3、鞏固無菌操作技術(shù)。（二）實(shí)驗(yàn)原理

芽孢、莢膜染色法都是利用細(xì)菌各部位（分）的構(gòu)造不同，它們對(duì)染料的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細(xì)菌細(xì)胞的不同構(gòu)造能在顯微鏡下顯示出來，便于觀察和區(qū)別。

芽孢又稱內(nèi)生孢子（endospore），是某些細(xì)菌（革蘭氏染色陽性桿菌）生長(zhǎng)到一定時(shí)間（對(duì)數(shù)期后期），在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢圓形或圓柱形的結(jié)構(gòu)。

芽孢有的長(zhǎng)在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細(xì)菌生活史的一個(gè)環(huán)節(jié)，它還是檢驗(yàn)培養(yǎng)基滅菌徹底不徹底的依據(jù)。中央芽孢偏端芽孢游離芽孢末端芽孢芽孢染色原理

芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，當(dāng)用對(duì)比度大的復(fù)染色劑（蕃紅液）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，是芽孢和菌體更易區(qū)分。菌體呈紅色而芽孢呈綠色。莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖洗時(shí)被除去。

莢膜雖不是細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，但它是細(xì)胞外碳源和能源性貯藏物質(zhì)，并能保護(hù)細(xì)胞免受干燥的影響，同時(shí)能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬細(xì)胞的吞噬。莢膜染色原理

由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖洗時(shí)被除去。通常用負(fù)染色法染色，使細(xì)菌和背景著色，背景與菌體之間形成一透明區(qū)即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不用加熱固定。

1、菌種：蠟樣芽孢桿菌約2d營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；褐球固氮菌(Azotobacterchroococcus)約2d無氮營養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物。2、染色液和試劑：5％孔雀綠水溶液、0.5％蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、生理鹽水等；3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、乙醚酒精、擦鏡紙等。（三）實(shí)驗(yàn)器材制片→染色（孔雀綠5min）→水洗→復(fù)染（蕃紅花紅2-3min）→水洗→干燥→鏡檢1、芽孢染色(四）實(shí)驗(yàn)方法：切勿煮干芽孢染色結(jié)果（芽孢呈綠色，營養(yǎng)體及芽孢囊呈紅色）2、莢膜染色（濕墨水法）（1）制備菌和墨水混合液：加一滴墨水于潔凈的載玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌與之充分混合均勻；（2）加蓋玻片：將一潔凈蓋波片蓋在混合液上，然后在蓋波片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液；（3）鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察。莢膜染色結(jié)果背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。1、供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。2、染色加熱過程要及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸。3、莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。4、涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形。（五）注意事項(xiàng)（六）實(shí)驗(yàn)作業(yè)1．繪出表示芽孢桿菌的形態(tài)特征，注意芽孢的形狀、著生位置及芽孢囊的形態(tài)特征。

2．繪圖說明你所觀察到的細(xì)菌的菌體和莢膜的形態(tài)。1．若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營養(yǎng)細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因?2．組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?實(shí)驗(yàn)四放線菌和藍(lán)細(xì)菌形態(tài)的觀察目的要求實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)程序思考題一、目的要求學(xué)習(xí)觀察放線菌的基本方法加深理解放線菌的形態(tài)特征二、實(shí)驗(yàn)原理群體和個(gè)體形態(tài)形態(tài)觀察方法I放線菌形態(tài)的觀察FilamentousActinomycetesTypicalappearanceofastreptomycetegrowingonagarslantsThecolorsareduetotheproductionofpigmentsFilamentousActinomycetesAntibioticactionofsoilmicroorganismsonacrowdedplatestreptomycetesBacillusFilamentousActinomycetesStagesintheconversionofastreptomycete’s(鏈霉菌)aerialhyphaintospores(conidia)Varioustypesofspore-bearingstructuresinthestreptomycetesFilamentousActinomycetesSeveralspore-bearingstructuresofactinomycetes:Streptomyces.FilamentousActinomycetesAyoungcolonyofanactinomyceteofthegenusNocardia(奴卡(氏)(放線)菌屬)1、插片染色法28℃插片培養(yǎng)4-6d，輕輕取出蓋玻片，直接觀察鏡檢。觀察菌絲和孢子絲自然生長(zhǎng)的性狀，其中包括氣生菌絲（較粗）、基內(nèi)菌絲（較細(xì)）和孢子絲的形狀，如分枝狀況及孢子絲的卷曲等，并繪圖說明。首先尋找插在培養(yǎng)基的界面分界線，觀察營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲形態(tài)及分枝情況。調(diào)節(jié)亮度直接鏡檢

（二）觀察方法2.印片染色法微熱載玻片－印片－固定－石炭酸復(fù)紅染色1min－水洗－晾干－油鏡三、實(shí)驗(yàn)材料放線菌培養(yǎng)物：天藍(lán)色鏈霉菌4天培養(yǎng)物。顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、解剖針、解剖刀、酒精燈、鑷子等。酒精、蒸餾水等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.印片法：（1）接種培養(yǎng)用高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板，常規(guī)劃線接種，28℃下培養(yǎng)4-7天。（2）印片用滅菌的小刀(或刀片)挑取有單一菌落的培養(yǎng)基一小塊，放在潔凈的載玻片上。用鑷子取一潔凈載玻片，在火餡上稍微加熱，然后把玻片蓋放在帶菌落的培養(yǎng)基小塊上，再用小鑷子輕輕壓幾下，使菌落的部分菌絲體（氣生菌絲，孢子絲或孢子）壓在載玻片上。（3）固定：載玻片有印跡的一面向上，通過酒精燈火焰三次固定。（4）染色用石炭酸復(fù)紅覆蓋印跡，染色1-2min后水洗。（5）鏡檢干后用油鏡觀察。1.異形胞是由營養(yǎng)細(xì)胞組成的，一般比營養(yǎng)細(xì)胞大，在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)是空的。形成異形胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的貯藏顆粒溶解，光合作用片層破碎，形成新的膜，同時(shí)分泌出新的細(xì)胞壁物質(zhì)于細(xì)胞壁外邊。與營養(yǎng)細(xì)胞的區(qū)別是：壁厚；細(xì)胞質(zhì)中的顆粒物質(zhì)溶解，呈均勻狀態(tài)；原來的類囊體膜解體，形成新膜；顏色呈淡黃色或透明狀。異形胞的功能：一是將藻絲細(xì)胞分隔成藻殖段進(jìn)行營養(yǎng)繁殖；二是細(xì)胞內(nèi)含固氮酶，可直接固定大氣中的氮。II藍(lán)細(xì)菌形態(tài)的觀察異形胞厚壁孢子思考題在用插片法觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)時(shí)，要注意些什么？一、實(shí)驗(yàn)?zāi)颗c基本要求：學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，了解常見霉菌的基本特征。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1．觀察霉菌菌落形態(tài)。

2．用顯微鏡觀察霉菌裝片。

3．制作霉菌裝片并觀察其形態(tài)。實(shí)驗(yàn)五霉菌形態(tài)特征三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）菌落特征的觀察用肉眼觀察生長(zhǎng)在瓊脂平板上的各種霉菌菌落，并根據(jù)下列要求對(duì)每種霉菌的菌落特征加以描述。

1.菌落的大?。壕窒奚L(zhǎng)或蔓延生長(zhǎng)，菌落的直徑和高度。

2.菌落的顏色：正面和背面的顏色，培養(yǎng)基的顏色變化。

3.菌落的形態(tài)：棉絮狀、網(wǎng)狀、疏松或緊密、同心輪紋、放線狀的皺褶等。霉菌菌落各種曲霉的菌落各種病原真菌的菌落青霉的菌落青霉的菌落霉菌菌絲A、無隔菌絲B有隔菌絲隔膜（二）個(gè)體形態(tài)特征的觀察1.乳酸石炭酸制片法觀察

（1）制片：在干凈的載玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接種針從菌落邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置于液體中，再小心地把菌絲放開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。（2）鏡檢：

1）毛霉和黑根霉的孢子的形狀、顏色、大小、孢子囊、中軸體的形狀，有無假根和葡萄菌絲。

2）黑曲霉的分生孢子的形狀、顏色、大小、頂囊的形狀、小梗排列隔膜。

3）青霉的分生孢子的形狀、顏色、大小、小梗的排列方式，菌絲的隔膜。

（3）將觀察結(jié)果繪圖，并注意各部分名稱。霉菌的靜孢子

左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出靜孢子；右：囊軸

曲霉的分生孢子梗和頂囊上的分生孢子青霉的帚狀分生孢子梗和分生孢子曲霉的分生孢子頭彩圖霉菌的厚垣孢子2.插片培養(yǎng)觀察：

（1）插片培養(yǎng)：將已滅菌的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基平板上，一半露在外面，然后沿蓋玻片與培養(yǎng)基交接處接種霉菌孢子懸液。24到26度恒溫培養(yǎng)2到4天。

（2）制片、鏡檢：以無菌操作取下蓋玻片，有菌面朝下，放在滴有一滴棉蘭染液的載玻片上。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪制鏡檢形態(tài)圖

1．毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。

2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部五、問題和思考

1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點(diǎn)?2．濕室培養(yǎng)時(shí)為何用20%甘油作保濕劑?

實(shí)驗(yàn)六酵母菌的形態(tài)觀察、死活鑒別及大小測(cè)定I

酵母菌的形態(tài)觀察及死活鑒別（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）注意事項(xiàng)（六）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及出芽生殖方式；2、學(xué)習(xí)掌握區(qū)分酵母菌死、活細(xì)胞的染色方法；3、掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。（二）實(shí)驗(yàn)原理

酵母菌是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物。無性繁殖主要是出芽生殖。

本實(shí)驗(yàn)通過用美藍(lán)染色浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)（氧化型）藍(lán)色美藍(lán)（還原型）無色還原劑氧化劑

美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色。死活細(xì)胞鑒別原理美藍(lán)（氧化型）藍(lán)色美藍(lán)（還原型）無色酵母活細(xì)胞新陳代謝還原能力1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)約2d的麥芽汁斜面培養(yǎng)物；2、染色液和試劑：0.05％和0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液；3、器材：廢液缸、載玻片、蓋玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。（三）實(shí)驗(yàn)器材在載玻片中央加一滴0.1％呂氏堿性美藍(lán)染色液，用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均勻；用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上；(四）實(shí)驗(yàn)方法（美藍(lán)浸片）染液不宜過多或過少蓋玻片不宜平著放下將制片放置約3min，先低倍鏡后高倍鏡觀察酵母形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞。染色30min后再次觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量的變化；用0.05％的呂氏堿性美藍(lán)染色液重復(fù)上述操作。1、加染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時(shí)，菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察；2、蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。（五）注意事項(xiàng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?）學(xué)習(xí)用測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小。2）掌握臺(tái)鏡測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺的使用方法。------顯微鏡測(cè)微技術(shù)

II酵母細(xì)胞大小測(cè)定二、材料與儀器1、釀酒酵母2、顯微鏡、物鏡測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺微生物細(xì)胞大小，是其形態(tài)特征重要標(biāo)志之一。每一種微生物在一定條件下，有其相對(duì)固有的大小形態(tài)。它是分類鑒定的依據(jù)之一。其大小測(cè)定可用測(cè)微尺測(cè)量。測(cè)微尺分為目鏡測(cè)微尺和物鏡測(cè)微尺兩部分。三、基本原理

目鏡測(cè)微尺：是一塊可以放入接目鏡內(nèi)的特定圓形玻璃片。玻片中央是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)帶刻度的尺，等分成50或100小格，每個(gè)等分線間距為0.1mm。由于不同顯微鏡的放大倍數(shù)不同，故目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際代表長(zhǎng)度隨顯微鏡的不同而不同。因此在使用前必須用物鏡測(cè)微尺校正，以求得在一定接物鏡及目鏡等光學(xué)系統(tǒng)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。

物鏡測(cè)微尺是一塊中央部分刻有精確等分線的載玻片。每一刻度間距為10um即把1mm等分為100格，是專門為校正目鏡測(cè)微尺實(shí)際數(shù)值用的。四、方法與步驟1、目鏡測(cè)微尺的校正1）將目鏡測(cè)微尺裝入目境內(nèi)，刻度朝下，并將物鏡測(cè)微尺朝上置載物臺(tái)上。2）用低倍鏡核對(duì)，至能清晰看到物鏡測(cè)微尺。3）改用高倍鏡或油鏡對(duì)焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微的刻度和物鏡測(cè)微尺刻度平行。4)兩尺吻合后，先使兩尺的一端某一刻度完全重合，然后再尋找另一端第二條重疊的刻度。5)計(jì)下兩吻合刻度間，目鏡測(cè)微尺與物鏡測(cè)微尺的格數(shù)。按下列公式算出目鏡測(cè)微尺每小格所代表長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（微米）兩吻合刻度間物鏡測(cè)微尺格數(shù)×10μm=

兩吻和刻度間目鏡測(cè)微尺格數(shù)例如：目鏡測(cè)微尺的5格等于物鏡測(cè)微尺的2格，則目鏡測(cè)微尺1格=（2×10）/5=4微米目鏡測(cè)微尺安裝方法目鏡測(cè)微尺目鏡測(cè)微尺一鏡臺(tái)測(cè)微尺及其中央部分的放大鏡臺(tái)測(cè)微尺校準(zhǔn)目鏡測(cè)微尺時(shí)的情況2、酵母細(xì)胞大小測(cè)定：1）制作酵母水浸片2)取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，將“水浸片”標(biāo)本置于載物臺(tái)上。3）先用低倍鏡觀察到目標(biāo)后，轉(zhuǎn)換高倍鏡測(cè)量酵母的大小，測(cè)量10—20個(gè)菌體，求出其平均值。四、測(cè)量結(jié)果記錄：在高倍鏡下：目鏡測(cè)微尺——格=物鏡測(cè)微尺——格目鏡測(cè)微尺1格=微米酵母細(xì)胞長(zhǎng)度=目鏡測(cè)微尺平均——格=——微米寬度=目鏡測(cè)微尺平均——格=——微米注：要求測(cè)量10個(gè)酵母細(xì)胞的平均值五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)

繪圖說明你所觀察到的酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及出芽生殖方式。1、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？試分析其原因。

2、為何更換不同倍數(shù)目鏡和物鏡時(shí)，必須要重新標(biāo)定？第七章微生物的數(shù)量測(cè)定I顯微鏡直接計(jì)數(shù)法II稀釋涂布法（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法I顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解顯微鏡計(jì)數(shù)的原理；2、學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物直接計(jì)數(shù)的方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理

利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是微生物實(shí)驗(yàn)中一種十分重要的常用微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速，不論微生物的生理狀況如何，都可以在顯微鏡下一一計(jì)數(shù)。由于此法得到的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上四條縱槽構(gòu)成了三個(gè)平臺(tái)，中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分成9個(gè)大方格，中央的大方格為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)1mm，共有400個(gè)小方格，加蓋玻片于突起部分上時(shí)，即形成一個(gè)體積為0.1mm3的計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的規(guī)格有兩種：一種是25個(gè)中方格×16個(gè)小格，另一種是16個(gè)中方格×25個(gè)小格，所以小方格的總數(shù)是相同的，都為400個(gè)。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。如果設(shè)五個(gè)中方格的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)即（0.1mm3中的總菌數(shù)）為A／5×16(或25)×B。所以1ml菌液中的總菌數(shù)=A／5×16（或25）×10×1000×B。（三）實(shí)驗(yàn)器材1.菌種

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌懸液2.器具

顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酒精燈、接種環(huán)、無菌水、吸管、蓋玻片、計(jì)數(shù)器。（四）實(shí)驗(yàn)方法1.稀釋

將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2.鏡檢計(jì)數(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多）讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。4.顯微鏡計(jì)數(shù)

靜置幾分鐘，將計(jì)數(shù)板放在顯微鏡下，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室，再換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)；每個(gè)計(jì)數(shù)室選右上右下、左上左下和中間的五個(gè)中方格中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)兩次5.清洗血球計(jì)數(shù)板

計(jì)數(shù)完畢，將計(jì)數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，鏡檢觀察每小格內(nèi)無殘留物為止。

注意事項(xiàng)1、加樣時(shí)先搖勻菌液，計(jì)數(shù)室中不可有氣泡產(chǎn)生；2、計(jì)數(shù)時(shí)，格線上的菌體只數(shù)上方和右邊線上的；3、如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，作為兩個(gè)菌體計(jì)算；4、清洗計(jì)數(shù)板時(shí)切勿用手或硬物刷洗。II稀釋涂布法（一）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1、倒平板：每皿約15ml，2、編號(hào)：對(duì)平板和稀釋用試管分別編號(hào)。3、稀釋：放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。4、取樣：選擇合適的三個(gè)稀釋度，用三支無菌吸管分別吸取三個(gè)稀釋度的菌懸液，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。5、涂布：用滅過菌的涂布棒將菌懸液均勻涂布在平皿表面。涂完后，旋轉(zhuǎn)90度再涂布。以上倒平板、稀釋、涂布均要進(jìn)行無菌操作6、計(jì)數(shù)：培養(yǎng)48小時(shí)后，取出培養(yǎng)平板，一般選擇每個(gè)平板上有30—300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)數(shù)。算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式計(jì)算：每毫升中菌落形成單位（cfu）=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

計(jì)數(shù)室各格中菌數(shù)

總菌數(shù)

稀釋度菌數(shù)/ml平均值12345第一室第二室顯微直接計(jì)數(shù)結(jié)果(五)作業(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握玻璃器皿的洗滌和包扎方法；2.了解玻璃器皿的滅菌方法和原理；3.了解無菌操作臺(tái)的使用。實(shí)驗(yàn)八玻璃器皿的洗滌、包扎、滅菌及無菌操作臺(tái)的使用二、實(shí)驗(yàn)原理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用來培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。清潔的玻璃器皿是實(shí)驗(yàn)得到正確結(jié)果的先決條件，包扎方法要能保證防止污染雜菌?？盏牟Ａ髅笠话阌酶蔁釡缇?，若用濕熱滅菌，則要多用幾層報(bào)紙包扎。三、實(shí)驗(yàn)器材

試管、培養(yǎng)皿、吸管、棉花、包扎繩、三角瓶、電熱烘箱等。四、操作步驟

（一）玻璃器皿的洗滌方法1、新玻璃器皿的洗滌在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時(shí)，用自來水沖洗干凈。2、舊玻璃器皿的洗滌（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時(shí)或煮沸0.5小時(shí)，然后洗滌帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物后在洗滌（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復(fù)沖洗吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實(shí)驗(yàn)后集中沖洗。塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時(shí)然后洗滌吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗（3）載玻片與蓋玻片帶有香柏油：用皺紋紙擦或在二甲苯中搖晃幾次，然后在肥皂水中煮沸5-10分鐘，用軟布或脫脂棉擦拭，立即用自來水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡0.5-2小時(shí)，自來水沖洗，干后在95%乙醇中保存?zhèn)溆?。檢查過活菌的：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時(shí)然后按上述方法洗滌。（二）玻璃器皿的包扎1、培養(yǎng)皿的包扎：一般以5-8套培養(yǎng)皿做一包2、吸管的包扎：準(zhǔn)備好干燥的吸管，在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段1.5cm長(zhǎng)的棉花，然后將吸管尖端斜放在舊報(bào)紙條的近左端，與報(bào)紙成30度角，并將左端多余的一段紙覆折在吸管上，再將整根吸管卷入報(bào)紙，右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。3、試管和三角瓶等的包扎：試管口和三角瓶口用棉花塞或泡膜塑料塞，然后在棉花塞與管口和瓶口的外面用二層報(bào)紙與細(xì)線扎好。（三）滅菌

滅菌是指應(yīng)用物理或化學(xué)的方法，殺滅物體表面和內(nèi)部一切微生物營養(yǎng)體、芽孢和孢子。滅菌方法很多，可分為加熱、過濾、照射和化學(xué)藥品法等。常用加熱滅菌法：1、干熱滅菌：用火焰燒灼或電熱干燥箱內(nèi)高溫?zé)峥諝鉁缇?、濕熱滅菌⑴高壓蒸汽滅菌法⑵間歇滅菌法⑶煮沸消毒法1、干熱滅菌法A、原理：利用干的熱空氣使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。B、操作方法：裝入待滅菌物品→關(guān)門→升溫→恒溫→降溫→開箱取物。C、滅菌條件：160-170℃，1-2小時(shí)。

2.高壓蒸汽滅菌，1210C滅菌20分鐘。（四）無菌操作臺(tái)的使用垂直送風(fēng)水平送風(fēng)保持空間無菌操作紫外殺菌內(nèi)外壓力差五、結(jié)果記錄（略）六、思考題玻璃器皿干熱滅菌時(shí)應(yīng)該注意哪些問題，為什么？（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)實(shí)驗(yàn)九培養(yǎng)基的配制和滅菌（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、明確培養(yǎng)基的配制原則；2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；4、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理

培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽和水六類營養(yǎng)要素。由于不同微生物細(xì)胞組成不同，因而所需營養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基.

培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的成分、物理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。（三）實(shí)驗(yàn)器材1.藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％NaOH溶液、10％鹽酸溶液。2.器材：天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、PH試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。1.稱量

按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,瓊脂20.0g,蒸餾水1000ml,pH7.0。（四）實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)基的制備過程

稱量---溶解----調(diào)節(jié)pH值----過濾----分裝及包扎----滅菌----滅菌后試管擺放斜面2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使其溶解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所失水分。3.調(diào)節(jié)pH值用玻璃棒沾少許液體，測(cè)量PH值。用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)PH。4.過濾

用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。5.分裝及包扎根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)（用分裝漏斗）或三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。6.滅菌后試管擺放斜面注意事項(xiàng)1、稱取藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；2、蛋白胨極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速；2、配制固體培養(yǎng)基時(shí)，先將其他藥品加熱溶解到快沸時(shí)，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，此過程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢；4、分裝量根據(jù)試管大小和實(shí)際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的1/5，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/4，三角瓶的裝量不超過瓶體的1/2；5、分裝過程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。返回（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.思考牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基屬于何種培養(yǎng)基？2.為什么濕熱滅菌比干熱滅菌法更有效？（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ?shí)驗(yàn)原理（三）實(shí)驗(yàn)器材（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)實(shí)驗(yàn)十芽孢桿菌的分離純化及觀察（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解微生物分離和純化的原理2、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養(yǎng)的基本操作技術(shù)，掌握微生物的無菌操作技術(shù)。（二）實(shí)驗(yàn)原理

在自然界中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起的，為了生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離出它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)物，這種獲得純培養(yǎng)物的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得純種的微生物，一般根據(jù)該微生物營養(yǎng)或培養(yǎng)特點(diǎn)，或?qū)δ撤N抑制劑的耐受性不同，或?qū)δ撤N環(huán)境條件要求不同，從而制作或設(shè)置一些選擇性培養(yǎng)基，或選擇性培養(yǎng)條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。（三）實(shí)驗(yàn)器材1.樣品

土樣2.培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。3.其它

盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿。（四）實(shí)驗(yàn)方法圖14-1從土壤中分離微生物操作過程（一）稀釋涂布平板法（1）土壤稀釋液的制備

①稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水三角瓶中，振蕩15～20分鐘，使微生物細(xì)胞分散，靜置約20～30秒，即成10-1的土壤懸液。再將土壤懸液置于80-90℃水浴中保溫10min。②另取裝有9ml無菌水的試管，編號(hào)為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7，用無菌吸管吸取10-1土壤懸液lml，加入編號(hào)10-2的無菌試管中，吹吸三次，使之混合均勻，即成10-2的土壤稀釋液。再用另一支吸管吸取10-2試管中的土壤稀釋液1ml，加入編號(hào)10-3的無菌試管中，輕輕搖動(dòng)，使之混合均勻，即成10-3的土壤稀釋液，一定要每次更換一支無菌吸管（連續(xù)稀釋）。同法依次分別稀釋成10-4、10-5和10-6等一系列稀釋度菌懸液（2）平板制作

將無菌培養(yǎng)皿編上10-4、10-5、10-6號(hào)碼，每一號(hào)碼設(shè)三個(gè)重復(fù)，用1ml無菌吸管按無菌操作要求吸10-6稀釋液各1ml，分別放入編號(hào)10-6的三個(gè)培養(yǎng)皿中。同法吸取10-5稀釋液各1ml，分別放入編號(hào)10-5的三個(gè)培養(yǎng)皿中。再吸取10-4稀釋液各1ml，分別放入編號(hào)10-4的三個(gè)培養(yǎng)皿中。然后在9個(gè)培養(yǎng)皿中分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整個(gè)操作過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作（3）培養(yǎng)與移植

待平板完全冷凝后，將平板倒置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)，檢查分離結(jié)果。將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的斜面上，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其它雜菌混雜，就可再一次進(jìn)行分離、純化，直至獲得純培養(yǎng)。（二）平板劃線分離法交叉劃線法連續(xù)劃線法（三）培養(yǎng)及形態(tài)觀察

培養(yǎng)及觀察：平板置28～30℃培養(yǎng)2－3天，挑取菌落制片，用石碳酸復(fù)紅染色1-2min，鏡檢，觀察記錄菌體、芽孢的形態(tài)。并且觀察記錄單個(gè)菌落的培養(yǎng)特征。（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)1．在你所實(shí)驗(yàn)的三種培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落屬于哪個(gè)類群？簡(jiǎn)述它們的菌落形態(tài)特征。2．稀釋分離時(shí)，為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)？3．劃線分離時(shí)，為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉？劃線為何不能重疊？4．培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？實(shí)驗(yàn)十一抗稻瘟霉的芽孢桿菌的分離篩選一、目的要求了解病原菌拮抗菌的篩選方法了解芽孢桿菌具有作為拮抗菌開發(fā)的巨大潛力1、杯碟法采用抑菌圈法，亦稱平板擴(kuò)散法。杯碟法方法培養(yǎng)菌液溶化的瓊脂48℃混合倒平板放檢樣杯碟培養(yǎng)無菌操作有抑菌圈為陽性反應(yīng)二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理2、對(duì)峙培養(yǎng)法可將病原菌和測(cè)試菌分別相對(duì)著劃線接種，相隔大概2cm左右，當(dāng)測(cè)試菌對(duì)病原菌有拮抗作用，病原菌和測(cè)試菌之間就有一道“不可逾越的鴻溝”。此法簡(jiǎn)單易行，故被選定為本實(shí)驗(yàn)拮抗菌的篩選方法三、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、對(duì)峙培養(yǎng)法

采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選具有拮抗活性的菌株。接種灰霉病菌到PDA固體24℃培養(yǎng)一天后，①挑取拮抗菌的菌絲接種到距灰霉病菌落邊緣2cm左右處，24℃培養(yǎng)48-72h后觀察該菌株抑菌圈半徑的大??；②將分離純化的內(nèi)生細(xì)菌用接種環(huán)挑取少量在距灰霉病菌落邊緣2cm左右處，24℃培養(yǎng)48-72h后觀察該菌株抑菌圈半徑的大小。四、思考題1、為何本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)峙培養(yǎng)法而非杯碟法來篩選稻瘟霉的拮抗菌？食品或水中大腸菌群的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)十二一、目的要求了解食品衛(wèi)生微生物學(xué)的重要性及其原理2.學(xué)會(huì)水和食品中大腸菌群數(shù)的測(cè)定方法二、基本原理水和食品中的微生物數(shù)量主要考慮到的是細(xì)菌特別是病原菌的數(shù)量。這些細(xì)菌主要來源于土壤、垃圾、糞便等，尤其是后者。若飲用水、釀造水和食品中發(fā)現(xiàn)有大腸群細(xì)菌，就有可能存在腸道病原菌，可能會(huì)危害人們的健康，因此，進(jìn)行食品衛(wèi)生的微生物學(xué)檢驗(yàn)是十分重要的。一般情況下，主要是測(cè)定水和食品中細(xì)菌菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。細(xì)菌菌落總數(shù)是指水中或食品檢樣經(jīng)處理后，在一定條件培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，其主要作為判定水和食品被污染程度的標(biāo)志（采用稀釋涂布法測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)略）。大腸菌群是腸道最普遍存在和數(shù)量最多的一群細(xì)菌、常將其作為人畜糞便污染的標(biāo)志。水和食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示的。不同微生物發(fā)酵產(chǎn)物的不同，也是細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)。大腸桿菌：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，甲酸在酸性條件下可進(jìn)一步裂解生成H2和CO2產(chǎn)酸產(chǎn)氣志賀氏菌：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，但不能使甲酸裂解產(chǎn)生H2和CO2產(chǎn)酸不產(chǎn)氣三、材料與器皿(—)培養(yǎng)基1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化鈉5g1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸餾水1000mLpH7.2~7.4將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

3、品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供平板分離用）蛋白胨10g

乳糖10gK2HPO43.5g

瓊脂15～20g

蒸餾水1000mL

無水亞硫酸鈉5g左右

5％的堿性品紅乙醇溶液20mLpH7.2~7.44、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用，3和4可任選一種）蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42.0g瓊脂20g蒸餾水1000mL2％伊紅（曙紅）水溶液20mL5％美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液13mLpH7.2~7.4三、方法與步驟(一)水樣的采集供細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運(yùn)送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗(yàn)不應(yīng)超過4小時(shí)，在0～4℃下保存不應(yīng)超過24小時(shí)，如不能在4小時(shí)內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗(yàn)報(bào)告上注明保存時(shí)間和條件。

（1）自來水取樣：應(yīng)在水龍頭打開放水5分鐘，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后，瓶?jī)?nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗(yàn)項(xiàng)目聯(lián)合取樣，細(xì)菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前。（二）初發(fā)酵試驗(yàn)水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細(xì)菌盡量呈單個(gè)存在，即為10-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。

（2）接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基（接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡）中各加入水樣10mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL，小心混勻放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。此即5管法。（3）結(jié)果觀察：37℃中培養(yǎng)24h后取出觀察，觀察有無氣體（杜漢氏小管內(nèi)有無氣體）和酸產(chǎn)生（培養(yǎng)基有無變色）。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反應(yīng)。

(三)平板培養(yǎng)試驗(yàn)

將初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項(xiàng)：注意事項(xiàng)（1）劃線間距至少相隔0.5厘米；（2）接種釘尖端要稍彎；（3）先對(duì)試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣；（4）劃線時(shí)要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面．以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37℃培養(yǎng)18～24h。

24h后，觀察在平板上出現(xiàn)的單個(gè)菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37℃培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在．

(四)復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37℃培養(yǎng)24h，陽性反應(yīng)者即確認(rèn)為大腸菌群細(xì)菌。四、結(jié)果計(jì)算在初發(fā)酵試驗(yàn)中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細(xì)菌混在陽性可疑反應(yīng)管中，通過對(duì)初發(fā)酵中的陽性可疑管進(jìn)行平板和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，并進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細(xì)菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時(shí)只能把三步試驗(yàn)都呈陽性的試管計(jì)入陽性反應(yīng)管。如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)（MPN）。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經(jīng)下面的換算式計(jì)算。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報(bào)告值，即為MPN×10。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報(bào)告值，即為MPN×10。水樣的總大腸菌群檢索表出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719下略五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)過程。2、計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。六、思考題

用傾注平板法和涂布平板法計(jì)數(shù)，其平板上長(zhǎng)出的菌落有何不同？為什么要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間（48小時(shí)）后觀察結(jié)果？大腸菌群的定義是什么？大腸菌群中的細(xì)菌種類，一般并非是病原菌，為什么要選用大腸菌群作為食品被污染的指標(biāo)？實(shí)驗(yàn)十三微生物生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.通過大腸桿菌數(shù)量的測(cè)量理解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長(zhǎng)曲線；2.學(xué)習(xí)使用光密度法測(cè)定菌數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理適宜的條件下，在一定體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)某一純種微生物，并定時(shí)取樣，測(cè)定細(xì)胞的數(shù)目。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，可作出該種微生物的生長(zhǎng)曲線。經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。三、實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)、大腸桿菌液體培養(yǎng)物、無菌水、1ml、2ml和5ml無菌吸管、試管架、恒溫?fù)u床等。四、操作步驟

1、制備YEPD培養(yǎng)基2、活化菌種：活化三次。3、接種培養(yǎng)：接種2%的大腸桿菌菌于三角瓶液體LB培養(yǎng)基中，搖勻。取5ml放入滅菌的試管中（作為空白對(duì)照）。三角瓶于搖床中30℃培養(yǎng)。每隔2h取樣一次，均放入做好標(biāo)簽的滅菌空試管中，并于冰箱中保存。4、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

（1）總菌數(shù)的測(cè)定 將上述培養(yǎng)液逐次進(jìn)行稀釋，然后選擇合適的稀釋度進(jìn)行光密度值的測(cè)定。并作出大腸桿菌生長(zhǎng)過程中總菌數(shù)的變化情況。（2）活菌數(shù)的測(cè)定將上述培養(yǎng)液逐次進(jìn)