病毒感染的檢查方法與防治原則

病毒感染的檢查方法

與防治1整理課件病原學診斷的意義有助于臨床治療〔抗生素、干擾素等〕為控制病毒學疾病的流行提供實驗依據(jù)〔疫苗等〕2整理課件第一節(jié)病毒感染的檢查3整理課件病毒感染的檢查檢測內(nèi)容查病毒查特異性抗體病毒顆粒病毒抗原〔如血凝素〕病毒核酸〔PCR〕病毒酶類：如逆轉(zhuǎn)錄酶電鏡直接觀察光鏡檢查包涵體別離培養(yǎng)〔如IgM、IgG〕4整理課件一、標本的采集與送檢原那么根本與細菌相似，但應注意：1.標本用“雙抗〞〔2000-10000U〕或兩性霉素B〔2ug/ml)處理2.低溫保存，盡快送檢〔冰塊，CO2〕3.血清學診斷采雙份血清〔發(fā)病初，2-3周〕5整理課件二、病毒的別離與鑒定〔一〕病毒的別離培養(yǎng)細胞培養(yǎng)〔cellculture〕雞胚接種〔egginoculation〕動物接種〔animalinoculation〕6整理課件二、病毒的別離與鑒定一般程序：標本無菌處理動物接種雞胚培養(yǎng)細胞培養(yǎng)指標陽性指標陰性

病毒鑒定

盲傳2～3代指標陰性病毒陰性7整理課件〔一〕病毒的別離培養(yǎng)1.細胞培養(yǎng)〔簡述〕單層細胞培養(yǎng)〔monolayercellculture〕分類懸浮細胞培養(yǎng)〔suspendedcellculture〕原代細胞〔primarycell〕細胞種類二倍體細胞〔diploidcell〕傳代細胞系〔continuouscellline〕8整理課件病毒的細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)瓶單層細胞9整理課件1.細胞培養(yǎng)(1)原代和次代細胞培養(yǎng)組織組織塊分散的單個細胞單層細胞

剪碎

培養(yǎng)基(原代細胞)單層細胞(次代細胞)傳代培養(yǎng)蛋白酶10整理課件特點：①對多種病毒敏感②生長能力有限〔20代〕,獲取本錢高③可攜帶潛伏病毒〔EB〕1.細胞培養(yǎng)(1)原代和次代細胞培養(yǎng)11整理課件(2)二倍體細胞培養(yǎng)體外分裂50～100代仍保持二倍體染色體數(shù)目，可用于病毒別離和疫苗生產(chǎn)。特點：①對多種病毒敏感②不帶異種蛋白(人源性)

③不帶病毒，無致瘤潛能④可傳50-100代左右1.細胞培養(yǎng)12整理課件(3)傳代細胞培養(yǎng)特點：①對多種病毒敏感性高②繁殖能力高，傳代時間長③有致癌危險，不能用于疫苗生產(chǎn)〔由腫瘤細胞或二倍體細胞突變而來〕1.細胞培養(yǎng)13整理課件2.雞胚培養(yǎng)采用孵化9～14天的雞胚絨毛尿囊膜〔allantocherion〕痘苗病毒、人類皰疹病毒尿囊腔〔allantoiccavity〕接種部位流感病毒、腮腺炎病毒羊膜腔〔amnioticcavity〕流感病毒的初次別離卵黃囊〔yolksac〕嗜神經(jīng)病毒14整理課件尿囊腔15整理課件2、雞胚培養(yǎng)優(yōu)點：易管理，不帶微生物，本錢較低缺點：操作程序復雜16整理課件17整理課件18整理課件3.動物接種應用：尚無敏感細胞的病毒培養(yǎng)〔HCV等〕動物：兔、鼠、黑猩猩、猴等優(yōu)點：結果易觀察，可建立動物模型缺點：有飼養(yǎng)條件要求，費用高，動物體內(nèi)常帶有潛伏病毒，平安性要求高19整理課件1．病毒增殖鑒定(1)細胞病變效應〔cytopathiceffect,CPE〕①細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等〔多數(shù)病毒〕；②形成多核巨細胞或稱融合細胞〔麻疹病毒、巨細胞病毒、呼吸道合胞病毒等〕；③在培養(yǎng)細胞中形成包涵體〔狂犬病病毒、麻疹病毒等〕。〔二〕病毒的鑒定20整理課件21整理課件①細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落(1)細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)22整理課件麻疹病毒感染細胞呼吸道合胞病毒感染細胞②形成多核巨細胞或稱融合細胞(1)細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)23整理課件③形成包涵體(inclusionbody)(1)細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)24整理課件腮腺炎病毒感染細胞(2)紅細胞吸附〔hemadsorption〕病毒囊膜外表血凝素(HA)＋紅細胞外表HA受體25整理課件(3)干擾現(xiàn)象〔interference〕風疹病毒＋人胚腎細胞病毒增殖，CPE(－)埃可病毒＋人胚腎細胞病毒增殖，CPE(＋)＋人胚腎細胞風疹病毒？?？刹《尽?〕CPE(-)—風疹病毒(+)埃可病毒(-)CPE(+)—風疹病毒(-)?？刹《?+)26整理課件(4)細胞代謝改變細胞代謝變慢pH改變〔adenovirus〕27整理課件2.病毒形態(tài)學鑒定電子顯微鏡：設備、操作復雜，應用受限光學顯微鏡：可見大病毒〔痘類病毒〕，對一般病毒檢測意義不大28整理課件3.病毒血清學鑒定鑒定病毒種、型、亞型(1)血凝抑制試驗〔hemagglutinationinhibitiontest〕—正粘病毒型與亞型鑒定

病毒＋雞紅細胞＝凝集〔血凝試驗/血凝效價〕

病毒＋特異性抗體＋雞紅細胞＝不凝集〔血凝抑制試驗〕29整理課件30整理課件(2)免疫標記法〔FIA、EIA/ELISA、RIA〕——多種病毒鑒定(3)凝膠免疫擴散試驗(gelimmuno-diffusiontest)——多種病毒鑒定3.病毒血清學鑒定31整理課件4.病毒分子生物學鑒定抗原變異病毒基因的鑒定核酸擴增核酸雜交基因芯片基因測序32整理課件〔三〕病毒數(shù)量與感染性測定1.血凝試驗：病毒總量〔活病毒＋死病毒〕2.蝕斑形成試驗〔plaqueformationtest〕3.50％組織細胞感染量〔50％tissuecultureinfectiousdose,TCID50〕感染性病毒量(PFU)33整理課件34整理課件CalculateTCID50.Formula:

TCID50/100ul=[(%positivevalue>50%)?50%]/[(%positivevalue>50%)?(%positivevalue<50%)]*logDilutionfactor#

+(logdilution>50%)

#：10-folddilution,itis1.35整理課件(四)新病毒的鑒定核酸類型的測定(PCR)理化性狀的檢測〔如對干、熱、酸、脂溶劑的敏感性等〕形態(tài)學鑒定〔電鏡〕血清學鑒定〔中和試驗〕基因測序和生物比照〔序列同源性分析〕36整理課件三、病毒感染的血清學診斷應用于：①采取標本別離病毒為時已晚②目前尚無別離此病毒的方法或難以別離的病毒③為證實所別離的病毒的臨床意義④進行血清流行病學調(diào)查等37整理課件1.中和試驗〔neutralizingtest〕病毒＋中和抗體

病毒失去感染性

特點：特異性高，抗體維持時間長應用：人群免疫情況的調(diào)查臨床診斷少用38整理課件2.補體結合試驗

〔complementfixationtest〕用病毒可溶性補體抗原檢測病人血清中相應的補體抗體特點：特異性低，抗體出現(xiàn)早，消失快應用：近期感染指標。39整理課件四、病毒感染的快速診斷數(shù)小時內(nèi)出結果病毒顆粒病毒成分〔抗原或核酸〕早期抗體檢測〔IgM〕40整理課件〔一〕形態(tài)學檢查電鏡和免疫電鏡檢查普通光學顯微鏡檢查〔包涵體〕41整理課件〔二〕病毒成分檢測1.病毒蛋白抗原檢測免疫標記技術2.病毒核酸檢測核酸擴增技術核酸雜交技術基因芯片技術

基因測序42整理課件病毒引物43整理課件44整理課件45整理課件〔三〕早期抗體檢測可診斷急性感染特異性IgM抗體：孕婦感染風疹病毒EA早期抗原抗體〔急性感染晚期方可檢出〕EB病毒VCA衣殼抗原抗體〔IgG急性感染期較早出現(xiàn)，終身可保持高水平；IgM僅于急性感染期出現(xiàn)〕EBNA核心抗原抗體〔IgM并非所有病人都有〕

46整理課件第二節(jié)病毒感染的特異性預防微生物及其代謝產(chǎn)物生物制品動物免疫血清〔biologicalproducts〕免疫細胞細胞因子防治和診斷感染性疾病47整理課件滅活疫苗〔inactivatedvaccine〕活疫苗〔livingvaccine〕重組載體疫苗〔recombinantcarriervaccine〕亞單位疫苗〔subunitvaccine〕化學提取或人工合成疫苗重組疫苗〔recombinantvaccine〕核酸疫苗〔nucleicacidvaccine〕一、人工主動免疫常用生物制品48整理課件二、人工被動免疫常用生物制品免疫球蛋白血清丙種球蛋白〔緊急預防〕細胞免疫制劑〔病毒、腫瘤的治療〕IFN-α、β、γ細胞因子IL-2、IL-6、IL-12TNF、CSF淋巴因子激活的殺傷細胞——LAK細胞49整理課件第三節(jié)病毒感染的治療

核苷類藥物

非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑蛋白酶抑制劑其他抗病毒藥物干擾素和干擾素誘生劑中草藥基因治療劑治療性疫苗

抗病化學制劑反義寡核苷酸干擾RNA核酶〔ribozyme〕50整理課件核苷類藥物作用機制之一HSV/VZV無環(huán)鳥苷〔NA〕病毒胸苷激酶NA一磷酸宿主細胞激酶NA三磷酸〔缺乏糖環(huán)3’-OH基〕病毒DNA聚合酶抑制DNA復制：核酸鏈延伸被迫終止較高親和力51整理課件干擾RNA

2006諾貝爾醫(yī)學生理學獎

瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院２日宣布，將２００６年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予美國科學家安德魯·法爾和克雷格·梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了ＲＮＡ〔核糖核酸〕干擾機制。

諾貝爾獎評審委員會發(fā)布的公報說，法爾和梅洛獲獎是因為他們“發(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動的根本機制〞，這一機制為控制基因信息提供了根底性的依據(jù)。公報指出，ＲＮＡ干擾已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未來幫助科學家開發(fā)出治療疾病的新療法。ＲＮＡ干擾機制的發(fā)現(xiàn)使得科學家可以對侵入細胞的病毒ＲＮＡ進行控制。諾貝爾獎評審委員會指出，ＲＮＡ干擾機制將來有望應用于臨床醫(yī)學和農(nóng)業(yè)等眾多領域，用來