酪氨酸解氨酶（TyrosineammonilyaseTAL）試劑盒說明書

第第頁酪氨酸解氨酶（Tyrosineammonilyase，TAL）試劑盒說明書酪氨酸解氨酶（Tyrosineammonilyase，TAL）試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測定前務必取23個預期差別較大的樣本做猜測定測定意義：TAL廣泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶之一、TAL能夠躍過肉桂酸4羥基化酶（C4H）直接將酪氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酸，香豆酸可進一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗變老作用的苯丙素類自然產(chǎn)物。測定原理：TAL能夠分解酪氨酸產(chǎn)生香豆酸，使反應溶液333nm下的吸光度隨反應時間而上升，依據(jù)吸光度的變動率可計算出TAL活性。需自備的儀器和用品：酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水試劑構成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×2瓶，4℃保管；試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保管；粗酶液提?。?、細菌、細胞或組織樣品的制備：細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）果汁等液體樣品：直接檢測。測定步驟：1、酶標儀預熱30min以上，調(diào)整波長至333nm。2、準備96孔UV板一塊（非普通酶標板，普通酶標板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于340nm務必使用UV板）。3、試劑二的配置：臨用前在試劑二瓶中加入10mL試劑一充分溶解待用（用不完的試劑4℃保管一周，注意現(xiàn)配現(xiàn)用），在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。4、在EP管中依次加入如下試劑試劑名稱（μL）測定管對照管樣本上清4040試劑一360試劑二360充分混勻，40℃保溫60min試劑三2020混勻，10000g4℃離心5min，取200μL上清至96孔UV板，333nm下測定吸光值A測定與A對照，ΔA=A測定A對照TAL活性計算：1、血清（漿）或果汁TAL活性單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應體系中使333nm處吸光值變動0.005為一個酶活力單位。TAL（U/mL）=ΔA×V反總÷（V樣÷V樣總）÷0.005÷T=35×ΔA2、組織、細菌或細胞TAL活性（1）按樣本蛋白濃度計算：單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使333nm處吸光值變動0.005為一個酶活力單位。TAL（U/mgprot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T=35×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。（2）按樣本鮮重計算：單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應體系中使333nm處吸光值變動0.005為一個酶活力單位。TAL（U/g鮮重）=ΔA×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷0.005÷T=35×ΔA÷W（3）按細菌或細胞密度計算：單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使333nm處吸光值變動0.005為一個酶活力單位。TAL（U/104cell）=ΔA×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷0.005÷T=0.07×ΔAV反總：反應體系總體積，0.42mL；V樣：加入樣本體積，0.