透射電鏡和免疫電鏡樣本制備常見問題和解決方案-卡梅德生物

透射電鏡/免疫電鏡樣本制備常見問題和解決方案膠體金顆粒沒有結(jié)合上是什么原因？如何避免？[1]原因：造成這種現(xiàn)象可能是由于抗原的量低；抗體由于滴度低、儲存不當或年限較長、稀釋不當或過度冷凍和解凍等原因?qū)е碌馁|(zhì)量問題；溶液的pH值可能過高或呈堿性；嚴重的陰性染色可能會掩蓋金顆粒。改善方法：使用更長的孵育時間和更濃縮的初級抗體，還可以通過調(diào)節(jié)pH或降低負染料的濃度和/使用較大的金顆粒來改善這種情況。電子顯微鏡檢查時涂層不穩(wěn)定的原因？如何避免？[2]原因：由于電子束與薄膜和樣品的相互作用而引起的薄膜加熱。改善方法：隨著時間的推移，當電子束穿過柵格時，通過緩慢增加電子束的強度來穩(wěn)定薄膜；使用真空蒸發(fā)器在格柵上再涂一層直接碳。背景金顆粒過多的原因？如何避免？[2]（1）如果是在塑料薄膜上，則該部分可能沒有暴露在溶液中（由于側(cè)面朝上），因此在轉(zhuǎn)移和清洗格柵時要小心，將裝有樣品的格柵面朝上；（2）抗原在制備過程中受到破壞，使用不同的程序在1%多聚甲醛中進行短鏈反應；（3）溶液的離子濃度可能很低，提高鹽濃度（高達2.5%）。在孵育溶液中添加卵清蛋白、BSA或正常山羊血清（不適用于蛋白A）至約1%。（4）在孵育期間，切片可能沒有被充分清洗，增加洗滌步驟；（5）抗體的非特異性電荷吸引可引起背景，在所有溶液中使用1%的洗滌劑（例如，Tween20）。在所有溶液中加入正常山羊血清（不含蛋白A），一抗培養(yǎng)前正常山羊血清濃度增高。金顆粒發(fā)生聚集的原因？如何避免？[3]原因：一抗混雜，形成團塊；聚集可能是由金共軛物的自然放大因子引起。對于IgG-金顆粒偶聯(lián)物，多達10個偶聯(lián)金顆?？梢愿街谝豢沟腇c組分上，在切片上產(chǎn)生團簇的外觀，但這種情況一般不會發(fā)生在蛋白偶聯(lián)物上。改善方法：使用新鮮的抗血清；如有需要，可使用更高稀釋度的金顆粒。染色密度太大，無法辨別結(jié)構(gòu)細節(jié)怎么辦？[4]原因：網(wǎng)格上的污漬太多了；染色濃度過高；調(diào)整瞬變電磁加速電壓。改善方法：濾紙吸附去除污漬，然后在染色過程中去除網(wǎng)格；降低染色濃度；增加加速電壓可以降低圖像對比度。樣品不均勻地分散在網(wǎng)格上怎么辦？[4]因為有支撐膜的柵格往往是疏水的，可以使用潤濕劑使網(wǎng)格更疏水；滴入細菌肽（50μg/ml）、poly-L-賴氨酸（1μg/ml）或牛血清白蛋白（0.05%至0.005%w/v）孵育30-60秒；還可以直接將潤濕劑添加到樣品中以幫助擴散。樣本固定劑有哪些種類？[5]戊二醛是一種五碳雙醛，它有用性質(zhì)是能交聯(lián)蛋白質(zhì)。新鮮制備的葡二醛在中性pH下也會聚合成長鏈二醛，它提供可變大小的交聯(lián)，有效地穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。多聚甲醛通常與戊二醛結(jié)合，以更好地穩(wěn)定生物樣品。一般來說，當固定劑被鑒定為含有多聚甲醛時，通常意味著它們含有由甲醛的多聚甲醛聚合物產(chǎn)生的甲醛。這種新制備的一碳一醛甲醛在水溶液中反應為亞甲基乙二醇，其優(yōu)點是其快速滲透特性和聚合和交聯(lián)蛋白質(zhì)和核酸的能力，也可以改變脂類的化學性質(zhì)。丙烯醛是另一種高活性固定劑，通常與其他醛(如戊二醛和/或多聚甲醛)結(jié)合使用，用于固定非常致密的樣品。八．透射電鏡樣本分為哪幾種類型？[5]（1）固體粉末樣本：將粒徑符合要求的粉末溶解在有機溶劑無水乙醇中，用超聲的方法將樣品盡可能地分散開，然后用支持網(wǎng)撈起來；（2）大部分的TEM樣本是薄膜類的樣本，該類樣本可以做靜態(tài)觀察，如樣本組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)分布，密度，狀態(tài)等；也可以做動態(tài)原位觀察，如相變，形變，位錯運動及其相互作用。（3）金屬類的樣本的表面復型，即把需要觀察的金屬樣本的表面形貌（表面顯微組織的凹凸情況）用適宜的非晶薄膜復制出來，再對金屬樣本表面形貌的復制膜進行透射電鏡觀察與分析，以觀察樣本組織，斷口的外形，表面凹凸情況及磨損程度，二維的形態(tài)和分布、及結(jié)構(gòu)分析?？返律铮↘MDBioscience）(/)擁有專業(yè)的科學家和成像實驗室，可為包括植物樣本、動物樣本、細菌和病理標本在內(nèi)的生物科學和臨床研究提供全面的透射電子顯微鏡（TEM）和掃描透射電子顯微鏡（STEM）服務。我們經(jīng)驗豐富的專家可以為樣品收集、制備和評估提供實驗設計指導。我們還提供有關(guān)圖像和結(jié)果的專業(yè)病理咨詢。YongchangC,FengweiW.InvestigationofProliferationandDifferentiationofGastricEpithelialCellsofFetalratbyElectronicMicroscopeandImmunohistochemicalMethods[J].JOURNALOFZHENJIANGMEDICALCOLLEGE,1999.McleanIW,NakanePK.Anewfixativeforimmunoelectronmicroscopy[J].ArchivesofPathology&LaboratoryMedicine,1974,100:405-414.Tremblay,Marie-éve,RiadM,MajewskaA.PreparationofMouseBrainTissueforImmunoelectronMicroscopy[J].JVisExp,2010(41).DOI:10.3791/2021.GriffithsG,SimonsK,WarrenG,etal.Immunoelectronmicroscopyusingthin,frozensections:applicationtostudiesoftheintracellulartransportofSemlikiForestvirusspikeglycoproteins.[J].MethodsinEnzymology,1983,96:466-485.DOI:10.1016/S0076-6879(83)96041-X.Stefan,Geimer,Michael,etal.CentrinscaffoldinChlamydomonasreinhardt