糖原合成酶（GlycogensynthaseGCS）試劑盒說(shuō)明書

第第頁(yè)糖原合成酶（Glycogensynthase，GCS）試劑盒說(shuō)明書糖原合成酶（Glycogensynthase，GCS）試劑盒說(shuō)明書微量法100管/96樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：GCS（EC2.4.1.11）催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UTP，以α1，4糖苷鍵相連延長(zhǎng)糖鏈，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。測(cè)定原理：GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映GCS活性。需自備的儀器和用品：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體18mL×1瓶，4℃保存；試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保存；試劑三：液體16.4uL×1支，4℃保存；試劑四：粉劑×1支，20℃保存；試劑五：粉劑×1支，20℃保存；樣本的前處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。3、試劑五的配制：臨用前在試劑五中加入1mL試劑二充分溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。4、將工作液和試劑五置于37℃預(yù)熱5分鐘。5、在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1A2.注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA小于0.1可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。GCS活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。GCS（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3215×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。GCS（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。GCS（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。GCS（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔