DB21∕T 3429-2021 蒙古櫟SSR分析技術(shù)規(guī)程

65.020.01CCS

B

60DB21 21/T

3429—2021蒙古櫟

分析技術(shù)規(guī)程Technical

of

SSR

analysis

in

Quercus

遼寧省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布前 言

...........................................................................

II1

..............................................................................

12

規(guī)范性引用文件

....................................................................

13 術(shù)語和定義

........................................................................

14 儀器設(shè)備及試劑

....................................................................

15

..............................................................................

26

溶液配制

..........................................................................

27

分析程序

..........................................................................

2附

錄

A

（資料性）

..................................................................

5附

錄

B

（資料性）

..................................................................

6附

錄

C

（資料性）

..................................................................

7附

錄

D

（資料性）

..................................................................

8DB21/T

3429—2021 本文件按照GB/T

1.1的規(guī)則起草。本文件由遼寧省林業(yè)和草原管理局提出并歸口管理。本文件起草單位：遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院。高旭、李昀峰、扈延伍、曹穎、劉金義、龐家舉、許家銘、翟金鳳、趙濟(jì)川、戰(zhàn)金偉。我們將及時答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省林業(yè)和草原局（遼寧省沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話12024-82241813。DB21/T

3429—2021

SSR

1 本文件規(guī)定了蒙古櫟SRR分析技術(shù)的定義和術(shù)語、儀器設(shè)備、溶液配制、引物和分析程序。本文件適用于遼寧地區(qū)蒙古櫟的SSR分析。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

28660馬鈴薯種薯真實(shí)性和純度鑒定

分子標(biāo)記LY/T

2426

SSR

分子標(biāo)記法LY/T

2756 白蠟品種分子鑒定方法—SRAP

3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1簡單重復(fù)序列又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由1～6個核苷酸為重復(fù)單位的長達(dá)幾十至幾百個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在耐熱

DNA

聚合酶作用下，于體外快速大量特意擴(kuò)增待定

DNA

序列的方法。3.3引物一條互補(bǔ)結(jié)合在模板

鏈上的短的單鏈，提供

3’

末端作為

合成的起點(diǎn)，延伸合成模板DNA

的互補(bǔ)鏈。3.4引物擴(kuò)增多態(tài)性一對引物在兩個或兩個以上不同材料基因組

之間擴(kuò)增，得到數(shù)目不同或長度不同的

4儀器設(shè)備及試劑DB21/T

3429—2021儀器設(shè)備及試劑見附錄B。5 引物相關(guān)信息見附錄C。6

溶液配制溶液配制方法見附錄D。7

分析程序7.1 分析材料采集蒙古櫟新鮮幼嫩葉片為材料提取基因組-8超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.2

的提取a)

CTAB

法提取蒙古櫟基因組

。將干凈研缽、研杵、小匙、無水乙醇預(yù)先放入冰箱中-20

℃預(yù)冷，用自來水、蒸餾水先后沖洗葉面，再用濾紙吸干水分。b) 取

5~10

g

葉片在液氮中迅速研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)至滅過菌的

500

μL預(yù)熱過（60

℃）的

CTAB

提取液、5

μL

0.2%

β-巰基乙醇和

5

μL

RNase

A(10

mg/mL)，充分混勻后放入

℃水浴

30

。其間每隔

輕輕搖動混勻

2

次

c) 取出離心管加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻

10

min，再于臺式冷凍離心機(jī)上

10

000

g

10

min。d)

1.5

mL

離心管中，重復(fù)

c)步驟

次。e) 移取上清液至另一已加入

2

1.5

mL

離心管中，輕輕顛倒混勻，使

DNA

沉淀成絮狀，-20℃放置

以上。f) 用鉤狀玻璃棒輕輕挑出絮狀沉淀并置于新的

mL

離心管中。如果樣品未出現(xiàn)云霧狀沉淀或看不清沉淀，10

000

g

10

min，再收集沉淀。g)

1

mL~1.5

mL

無水乙醇浸泡洗滌沉淀，輕搖幾分鐘，10

000

g

10

min，收集沉淀，重復(fù)

1

次。然后將離心管水平放置在清潔場所晾干或在超凈工作臺上吹干。h)

100

μL

滅菌的

TE

緩沖液溶解沉淀。7.3

濃度的檢測和定量用

TE

緩沖液配制l

μg/mL、2.5

μg/mL、5

μg/mL、7.5

μg/mL

和

的λ-DNA

分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取3

λ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液和3

μL

中提取的未知濃度溶液，在1%瓊脂糖凝膠上電泳15

min~20

，穩(wěn)壓90

V，電泳緩沖液為1×TBE，325

nm紫外燈下觀察，照相，檢測提取DNA的質(zhì)量。按照GB/T

28660要求的方法，計算提取DNA溶液的濃度。7.4

反應(yīng)7.4.1

反應(yīng)體系在4℃條件下進(jìn)行操作。15

μL反應(yīng)總體系中，含有10×PCR緩沖液

在4℃條件下進(jìn)行操作。15

μL反應(yīng)總體系中，含有10×PCR緩沖液

mmol/L，Mg

mmol/L，2+dNTPs

0.3

mmol/L，正向、反向引物各

μmol/L，Taq

DNA聚合酶

0.75

U，模板DNA

50

7.4.2

反應(yīng)程序擴(kuò)增程序首先94

℃預(yù)變性5

；隨后的35個循環(huán)為：94℃變性30

s，復(fù)性30

不同引物所需的退火溫度見附錄C)，72℃延伸30

s；最后72℃延伸8

，4℃保存。7.4.3

產(chǎn)物的處理PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在15

μL的反應(yīng)體系中加入5

μL的上樣緩沖液，充分混勻后，備用。7.5

產(chǎn)物檢測7.5.1

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測7.5.1.1 玻璃板的清洗用洗滌劑清洗玻璃板（長板和短板），自來水沖洗干凈，隨后將玻璃板用蒸餾水沖洗2屑紙巾沾取無水乙醇擦拭2遍，置于通風(fēng)櫥內(nèi)垂直晾干待用。7.5.1.2 膠槽裝配a) 玻璃板的固定將長板玻璃板平鋪于通風(fēng)櫥內(nèi)，邊條擦拭干凈后置于長板玻璃板兩側(cè)，隨后用短板玻璃板整齊地壓蓋住，確認(rèn)邊條與兩玻璃板均對齊后，將其放入封膠框中并用夾子固定在制膠板上。b) 配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸后用膠頭滴管吸取，沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中，避免出現(xiàn)氣泡，待瓊脂糖凝膠完全漫過玻璃板底部，停止灌注，放置于溫室下待其凝固后再進(jìn)行下一步操作。7.5.1.3 丙烯酰胺膠的配制在30

mL

8%聚丙烯酰胺貯備液中加入100

μL

10%過硫酸銨和200

μL四甲基乙二胺，迅速輕輕混勻。7.5.1.4 灌膠按照LY/T

2756要求的方法進(jìn)行灌膠。灌膠后，將梳子輕輕插入灌膠口中，室溫凝固30

。7.5.1.5 上樣和電泳待凝膠完全凝固后，將裝有凝膠的玻璃板輕輕從制膠板上取下，灌膠口向內(nèi)用夾子固定在電泳槽上，使用1×TBE緩沖溶液灌注電泳儀的上下兩槽，使下槽溶液漫過封膠框，上槽溶液漫過灌膠孔。垂直緩慢將梳子從灌膠口中拔出，并用1×TBE緩沖溶液清洗和整理樣品槽。使用200

μL移液器從左至右逐個對點(diǎn)樣孔進(jìn)行吹打，直至點(diǎn)樣孔內(nèi)無碎膠、氣泡以及其他雜質(zhì)。取5

μL步驟7.4.3處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，并在膠板的一側(cè)或適當(dāng)位置的點(diǎn)樣孔中加入4

μL的DNA

Marker

(DL2000

作為對照，電泳在200

V100

mA條件下進(jìn)行，電泳時間約為1.5

~2

h。7.5.1.6卸膠DB21/T

3429—2021電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，將上槽中1×TBE緩沖液放出，取下固定的夾子，去掉下部瓊脂糖，取下玻璃板。將玻璃板水平放置，用起膠鏟沿灌膠口一側(cè)邊緣將玻璃板緩慢撬起，將緊貼有凝膠的玻璃板放入裝有雙蒸水的洗膠盤中輕輕搖晃，待凝膠與玻璃板完全分離后，取出玻璃板，放凈雙蒸水。7.5.1.7 銀染

LY/T

2426

要求的方法，對電泳樣品進(jìn)行銀染檢測。7.5.1.8 譜帶記錄參照

電泳結(jié)果或掃描結(jié)果，根據(jù)每對

引物從檢測樣品中擴(kuò)增出的條帶數(shù)以及分子量大小，按“有”帶記錄為“1”、“無”帶記錄為“0”的方法，仔細(xì)記錄每對SSR引物的結(jié)果。建立

引物、檢測樣品及有無（）對應(yīng)擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)庫。7.5.1.9

標(biāo)記結(jié)果分析利用相關(guān)統(tǒng)計分析軟件，根據(jù)

（1973）的遺傳相似系數(shù)（Genetic

Similarity,

GS）按式（1）計算檢測樣品間的遺傳相似性水平。采用非加權(quán)組平均法（

unweighted

pair-group

method

arithmetic

means,

UPGMA）進(jìn)行聚類分析；繪制聚類分析結(jié)果圖，顯示

SSR

標(biāo)記的直觀結(jié)果?！?）式中：GS——遺傳相似系數(shù)，%；Ni——第

i

個樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)；Nj——第

j

個樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)；Nij——第

i

個樣品和第

j

個樣品共有的擴(kuò)增條帶數(shù)。7.5.2 7.5.2.1 樣品準(zhǔn)備對6-FAM和熒光標(biāo)記的產(chǎn)物用超純水稀釋30倍（注：不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物他的最適稀釋度通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。分別取等體積的上述2種稀釋液混合，從中吸取1

μL加入到基因分析儀專用96孔板中，在各孔分別加入

μL的分子量內(nèi)標(biāo)和

μL去離子甲酰胺，置于離心機(jī)中1

g下離心10

s。將樣品在儀上95℃變性3

min后上機(jī)測序。7.5.2.2 收集數(shù)據(jù)96得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件GeneMapper

中進(jìn)行自動分析。8

分析和鑒定用多對SSRSSR位點(diǎn)的多態(tài)性，從而分析不同種源或家系間的遺傳組成差異。DB21/T

3429—2021附

錄

A（資料性）原理A.1原理SSR廣泛分布于蒙古櫟基因組中，不同蒙古櫟種源或家系間每個SSR位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量可能不PCR位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量不同引起的不同長度PCRSSRPCR蒙古櫟種源或家系間遺傳組成差異進(jìn)行分析。物、

dNTPsMg

物、

dNTPsMg

-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)液、附

錄

B（資料性）儀器設(shè)備及試劑B.1 主要儀器設(shè)備PCR儀、基因分析儀、凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳槽及配套的制膠配件、垂直電泳槽及配套的制膠配件、臺式低溫高速冷凍離心機(jī)、超微量紫外/可見分光光度計、高壓滅菌鍋、液氮罐、超低溫冰箱、高壓電泳儀、移液器、超純水系統(tǒng)、水平搖床、電子天平、制冰機(jī)。B.2 試劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）、RNase

A、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、硼酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、引2+Marker、丙烯酰胺、過硫酸銨（）、四甲基乙二胺（TEMED)、甲醛、硝酸銀、冰乙酸、無水乙醇、甲叉雙丙烯酰胺、ROX-500括

FAX、熒光標(biāo)記DNA片段）、分析儀專用電泳緩沖液。附 錄

C（資料性）SSR（簡單重復(fù)序列）標(biāo)記引物序列表

C.1

SSR（簡單重復(fù)序列）標(biāo)記引物序列 引物序列（5’3’） (bp)F:

DB21/T

3429—2021

N1010265N1014482N1105306N1110207N1345390N12361N1247890N1457047N4544558N4529840

R:

ATGCCGAACCCTAACCTCTTF:

R:

F:

R:

F:

R:

F:

R:

F:

R:

F:

F:

R:

F:

R:

(CAA)9

180-192

51(AAT)6

171-202

50(TTC)7

150-168

50(CAA)8

164-183

52(GAC)7

135-153

50(CAAA)5

139-152

53(CTTT)6

185-205

54(AAAT)5

156-171

50(AAT)6

168-182

52(TTC)5

200-215

51DB21/T

3429—2021附

錄

D（資料性）主要試劑的配制D.1 常用貯備液D.1.1 0.5

mol/L

EDTA-二鈉（pH8.0）溶液將18.61

g

乙二胺四乙酸二鈉溶于80

H2O中，加入氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)至8.0，用超純水定容至

mL，高壓滅菌，4

℃保存。D.1.2 1

mol/L

（pH8.0）溶液將24.22

g三羥甲基氨基甲烷溶解于160

mL水中，用濃鹽酸（HCl）調(diào)節(jié)pH至，用超純水定容至200

mL，高壓滅菌，4

℃保存。D.1.3 5

mol/L

NaCl

將58.44

g氯化鈉（NaCl）溶于

mL水中，定容至

mL，高壓滅菌，4

D.1.4 CTAB

提取緩沖液緩沖液成分為2%（質(zhì)量濃度）溴代十六烷基三甲胺、100

mmol/L

Tris-HCl（1

mol/L

pH8.0）、mmol/L

EDTA（

mol/L，pH8.0）和1.4

mol/L

（5

mol/L）。在

超純水中加入20

gCTAB，

mL

1

mol/L

Tris-HCl（pH8.040

0.5

mol/L

EDTA（pH8.0

mL

5

mol/LNaCl1

L，高壓滅菌，4

℃保存。D.1.5 TE（pH8.0）緩沖液取1

mol/L

（pH8.0）1

，

mol/L

（pH8.0）0.2

，用水定容至100

，高壓滅菌，4

℃保存。D.1.6 10

mol/L

NaOH

稱取80

g氫氧化鈉（NaOH），先用

mL水溶解后，在加水定容至200

mLD.1.7 EB（1

mg/mL）溶液取0.05

gEB50

mL1

mg/mL。D.1.8 6×DNA

上樣電泳緩沖液

(DNA

Lording

6×DNA

Lording

0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴酚藍(lán)、0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲苯青、30mmol/LEDTA、

（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甘油和

2O。使用時按照每

5

μL

DNA

樣品加入

1

μL

DNA

上樣緩沖液的比例，混勻

DNA