誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展及其在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展及其在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用摘要：通過(guò)特定轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)使體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPS細(xì)胞），這一成果引起了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注.由于iPS細(xì)胞不僅具有與人類胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）相似的基本特征，而且與ES細(xì)胞相比，不存在免疫排斥和倫理道德問(wèn)題，因此，具有重要的臨床應(yīng)用潛能.目前，iPS細(xì)胞主要用于細(xì)胞分化和移植，并可提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法.從iPS細(xì)胞的產(chǎn)生、誘導(dǎo)方法、生物學(xué)特征和在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用作以研究！關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；重編程；再生醫(yī)學(xué)正文1iPS細(xì)胞的產(chǎn)生主要經(jīng)歷了3個(gè)大的階段.1981年，小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）建系干細(xì)胞是近30年來(lái)生物學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域（Evans和Kaufman），這些具有全能性的細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為不同類型的細(xì)胞，為組織修復(fù)開辟了新途徑.盡管這些細(xì)胞來(lái)源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，基本不存在去分化和重編程的問(wèn)題，但自誕生之日起，就一直深受倫理道德和異體排斥等問(wèn)題的困擾.隨著克隆羊“多利”的誕生，開創(chuàng)了體細(xì)胞在卵母細(xì)胞中去分化和重編程的先河.2000年，Munsie等從小鼠體細(xì)胞核移植囊胚中分離得到了小鼠ES細(xì)胞，從而拉開了治療性克隆研究的序幕，使利用病人的健康體細(xì)胞對(duì)自身的病變組織進(jìn)行修復(fù)成為了可能，盡管這一技術(shù)可以避免異體移植所造成的排斥反應(yīng)，但仍然深陷倫理道德爭(zhēng)論的漩渦之中.2006年，Yamanaka等將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類似于ES細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，即“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”（inducedpluripotentstemcells，iPS細(xì)胞）.2007年，Yu等和Takahashi等又分別采用相同的基因改造的方法將人的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為類ES細(xì)胞，這些劃時(shí)代的成果不僅解決了利用干細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)所面臨的免疫排斥和倫理學(xué)問(wèn)題，在利用病人正常細(xì)胞進(jìn)行組織自我修復(fù)方面具有巨大的應(yīng)用前景，而且是用來(lái)研究細(xì)胞去分化和基因組重編程的重要途徑（不需要胚胎或卵母細(xì)胞）.這個(gè)具有里程碑意義的發(fā)現(xiàn)揭開了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新篇章.2iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法迄今為止，短短幾年的時(shí)間內(nèi)iPS細(xì)胞的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，僅誘導(dǎo)方式而言，從病毒方法如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的轉(zhuǎn)座子載體和蛋白質(zhì)均能介導(dǎo)外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體誘導(dǎo)生成iPS細(xì)胞時(shí)，可能會(huì)引起外源基因整合到體細(xì)胞基因組，引起插入突變，如果將這些iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療，會(huì)存在安全隱患.因此，Aoi等利用不與宿主細(xì)胞整合的腺病毒、質(zhì)粒為表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞可以獲得iPS細(xì)胞，這對(duì)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展是一個(gè)重大進(jìn)步，但是該方法極低的誘導(dǎo)效率限制了其在實(shí)際研究中的應(yīng)用.隨后，部分研究小組嘗試?yán)肅re/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNA1載體及piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)等，將外源基因整合到受體細(xì)胞中誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，然后再將外源基因從iPS細(xì)胞的基因組中切除，從而得到不含外源基因整合的iPS細(xì)胞，該系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的效率明顯高于腺病毒和質(zhì)粒載體系統(tǒng)，達(dá)到0.1%～1%.但是，驗(yàn)證基因組不存在外源插入基因的過(guò)程十分繁瑣，且在基因剔除后，轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)有基因重排現(xiàn)象的發(fā)生.最近，Zhou等利用融合了4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的蛋白質(zhì)直接誘導(dǎo)受體細(xì)胞為iPS細(xì)胞.蛋白直接誘導(dǎo)iPS細(xì)胞在重編程過(guò)程中不會(huì)涉及任何的遺傳修飾，且蛋白容易失活.從iPS細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全角度來(lái)看，它是目前最安全的方法，但是需要進(jìn)一步提高其誘導(dǎo)效率才有可能被廣泛應(yīng)用.3iPS細(xì)胞的生物學(xué)特征ES細(xì)胞是全能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，在體外可以無(wú)限增殖.iPS細(xì)胞類似于ES細(xì)胞，也具有多向分化潛能和發(fā)育的全能性，可長(zhǎng)期增殖培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài).在正常培養(yǎng)體系中具有穩(wěn)定的二倍體核型，Yu等研究人和鼠iPS細(xì)胞核型時(shí)發(fā)現(xiàn)，只在極少數(shù)的細(xì)胞中出現(xiàn)畸形核，而大多數(shù)iPS細(xì)胞核型正常.但Aasen等發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代培養(yǎng)人iPS細(xì)胞至第13代時(shí)畸形核出現(xiàn)的幾率顯著增加，這與ES細(xì)胞的生長(zhǎng)特性相似.通過(guò)RT-PCR和免疫組化發(fā)現(xiàn)，iPS細(xì)胞也表達(dá)ES細(xì)胞特異的表面標(biāo)志，如SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA-1-81和TRA-2-49/6E等；并且iPS細(xì)胞具有向3個(gè)胚層分化的潛能和自我更新能力.但是，許多研究也發(fā)現(xiàn)，iPS細(xì)胞并不等同于ES細(xì)胞.Takahashi等［13］通過(guò)對(duì)人類iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞的32266個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的全序列基因表達(dá)圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，iPS細(xì)胞的1267個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因（4%）與ES細(xì)胞存在5倍左右的差異.Niwa等［14］研究也發(fā)現(xiàn)，iPS細(xì)胞中與多能性相關(guān)的關(guān)鍵基因（Oct4、Sox2和Rex1）的表達(dá)水平比人類ES細(xì)胞系（HSF1和H9）低兩倍.下面將從重編程過(guò)程中基因表達(dá)水平的變化、表觀遺傳學(xué)、發(fā)育潛能等方面分析iPS細(xì)胞的生物學(xué)特征.4iPS發(fā)育潛能特性細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)含有的信息量極大，可能只通過(guò)表觀遺傳學(xué)就可鑒定iPS細(xì)胞.但是，要了解并選擇最嚴(yán)格的檢驗(yàn)iPS細(xì)胞的指標(biāo)，利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析重編程過(guò)程、表觀遺傳學(xué)和發(fā)育潛能之間的相互作用有重要的意義.近期，Jaenisch和Young詳細(xì)地對(duì)檢驗(yàn)發(fā)育潛能的標(biāo)準(zhǔn)及其嚴(yán)格性進(jìn)行了比較［.對(duì)于iPS細(xì)胞最為嚴(yán)格的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)四倍體補(bǔ)償法形成完全來(lái)源于iPS細(xì)胞的成活后代，而體外分化是最不嚴(yán)格的檢驗(yàn)指標(biāo).但與ES細(xì)胞類似，由于倫理道德等問(wèn)題的限制，這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)只適于對(duì)小鼠等動(dòng)物多能干細(xì)胞發(fā)育潛能的測(cè)定，從而開始檢測(cè)人類iPS細(xì)胞發(fā)育潛能有效的方法只有體外分化和畸胎瘤的形成.目前，檢測(cè)iPS細(xì)胞發(fā)育潛能較嚴(yán)格的方法主要是由iPS細(xì)胞生成嵌合體動(dòng)物和畸胎瘤試驗(yàn).迄今為止，采用四倍體補(bǔ)償法來(lái)檢測(cè)iPS細(xì)胞發(fā)育潛能的報(bào)道很少.Wernig等采用四倍體補(bǔ)償法能使一些iPS細(xì)胞系（包括一個(gè)核型異常的細(xì)胞系）發(fā)育到胚胎階段，但是其發(fā)育程度卻不相同，有的能發(fā)育到中后期，有的只能發(fā)育到胚胎前期，而一些有相似表達(dá)圖譜、沒有任何明顯缺陷的iPS細(xì)iPS細(xì)胞有利于修復(fù)急性心肌梗塞等疾病.而Zhang等利用Oct4、Sox2、Nanog與Lin28產(chǎn)生的iPS細(xì)胞具有分化為心房、心室和竇房結(jié)細(xì)胞等的潛能，與ES細(xì)胞在向心肌分化的潛能方面相似.目前，雖然還沒有iPS細(xì)胞用于建造心血管疾病模型的報(bào)道，但是其應(yīng)用于建立心血管疾病模型指日可待.4.4糖尿病KeisukeTateishi等利用已建系的iPS細(xì)胞成功地誘導(dǎo)分化出分泌胰島素的胰島細(xì)胞，并在無(wú)血清和正常培養(yǎng)條件下皆可成功地使iPS細(xì)胞產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞.證明iPS細(xì)胞具有分化成胰島細(xì)胞和胰腺內(nèi)層的潛能，與ES細(xì)胞相似.而RenéMaehr等通過(guò)對(duì)1型糖尿病患者的成體成纖維細(xì)胞重新編程（Oct4，Sox2，Klf4），也可以得到iPS細(xì)胞.最近研究顯示，將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞（其數(shù)量決定糖尿病患者殘存胰島細(xì)胞的衰退進(jìn)程），并注入1型糖尿病和2型糖尿病小鼠體內(nèi)，通過(guò)測(cè)定血糖及血紅蛋白A1c水平顯示患病小鼠體內(nèi)血糖濃度降低并且血糖波動(dòng)性減輕.這表明，iPS技術(shù)可能是根治糖尿病非常有效的治療方式.4.5對(duì)其他人類疾病的研究目前，iPS細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的研究中，且已有多種遺傳病患者的特異性iPS細(xì)胞系被建立.同時(shí)，在不孕不育癥以及聽力、視力障礙等方面也進(jìn)行了初步研究.Park等將人源iPS細(xì)胞經(jīng)體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞（PGCs），其與體內(nèi)分離的PGCs在基因表達(dá)上極為相似，如果能夠進(jìn)一步將這些PGCs分化為精子和卵子，就有望治療不孕不育癥.Nishimura等將患者自體產(chǎn)生的iPS細(xì)胞經(jīng)糾正后，再分化為耳蝸神經(jīng)元并移植到小鼠體內(nèi)，1周后便可觀察到一些移植物開始表達(dá)谷氨酸標(biāo)記的神經(jīng)元.這些結(jié)果表明，iPS細(xì)胞可用來(lái)修復(fù)和移植受損的耳蝸神經(jīng).最近一項(xiàng)研究表明，由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的iPS細(xì)胞可分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，并將其移植到經(jīng)過(guò)免疫抑制處理的視網(wǎng)膜變性的小鼠身上，這些細(xì)胞形成了包含所有3個(gè)胚層組織的畸胎瘤，其中也有神經(jīng)視網(wǎng)膜.由此可見，iPS細(xì)胞可能是治療視網(wǎng)膜病變的一種手段.4.6iPS細(xì)胞作為體外疾病模型目前，iPS細(xì)胞可作為臨床藥物篩選細(xì)胞模型和人類疾病治療細(xì)胞模型.例如，將來(lái)自患者的iPS細(xì)胞[肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）]分化成特定的細(xì)胞（運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）來(lái)研究改善疾病癥狀的藥物.此外，Lee等以罕見神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的體細(xì)胞建立了iPS細(xì)胞系，并解析了該種疾病的發(fā)病機(jī)制，以此來(lái)測(cè)試若干候選藥物的療效.目前，iPS細(xì)胞廣泛地應(yīng)用于對(duì)人類疾病的研究，并建立了多種疾病的動(dòng)物模型，在不久的將來(lái)，有望成為治療人類疾病的一種手段.然而，在iPS細(xì)胞廣泛地應(yīng)用于臨床之前，還有許多問(wèn)題需要解決.實(shí)際上，這些問(wèn)題不只在iPS細(xì)胞領(lǐng)域備受關(guān)注，在人類ES細(xì)胞領(lǐng)域也很重視：1）需要進(jìn)一步驗(yàn)證是否有異源DNA引入到iPS細(xì)胞基因組中；2）生成人類ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的效率很低；3）雖然人類ES細(xì)胞/iPS細(xì)胞能定向分化成一些特定的細(xì)胞，但是產(chǎn)生所有需要的特異細(xì)胞類型還要付出很大的努力；4）此外，一旦分化成特定的細(xì)胞系后需鑒定體外生成的細(xì)胞是否與體內(nèi)相對(duì)應(yīng)細(xì)胞相似，并如何純化細(xì)胞.最近幾年，干細(xì)胞生物領(lǐng)域和iPS細(xì)胞在臨床應(yīng)用方面取得了巨大的進(jìn)步，但是這里提出的問(wèn)題可能仍要花數(shù)年時(shí)間才能被圓滿解決.5結(jié)語(yǔ)iPS細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)是目前研究的熱點(diǎn)，隨著iPS細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究的深入，iPS細(xì)胞必將開辟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元.目前，iPS細(xì)胞不僅為疾病治療和藥物篩選提供了理想的細(xì)胞模型，還可用于治療一些人類疾病，這是在再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域的有益嘗試，但還遠(yuǎn)未成熟，療效還缺乏長(zhǎng)期的實(shí)踐，其作用機(jī)制也存在很多盲點(diǎn).這項(xiàng)技術(shù)真正用于疾病的治療還有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走，如何高效獲得安全的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，如何定向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向某一特定類型的細(xì)胞分化并有效地將細(xì)胞移植入患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療等問(wèn)題還需要進(jìn)一步深入的研究.但其初步顯示出的臨床效果及安全性，使我們對(duì)未來(lái)的前景充滿期望，隨著人類對(duì)iPS細(xì)胞不斷地深入研究，相信iPS細(xì)胞會(huì)成為各種疾病患者的新希望.參考文獻(xiàn)（References）：1MUNSIEMJ，MICHALSKAAE，O′BRIENCM，etal.Isolationofpluripotentembryonicstemcellsfromreprogrammedadultmousesomaticcellnuclei[J].CurrentBiology，2TAKAHASHIK，YAMANAKAS.Inductionofpluripotentstemcellfrommouseembiyonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors[J].Cell.3誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)效率和方法的研究進(jìn)展張恩歡；胡智興；李瑪琳；4再生醫(yī)學(xué)與誘導(dǎo)干細(xì)胞的關(guān)系李林娟；顧一凡；5體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展王孟麗；沈曉麗；6YUJ，VODYANIKMA，SMUGA-OTTOK，etal.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells[J].Science7PARKIH，ARORAN，HUOH，etal.Disease-specificinducedpluripotentstemcells[J].Cell8自體誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞移植治療慢性腎功能不全的研究周敬9促進(jìn)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞心肌定向分化的實(shí)驗(yàn)研究馬珂；1