2024屆高考生物二輪專題復(fù)習(xí)與測試專題九生物技術(shù)與工程高考命題熱點十熒光定量PCR技術(shù)課件

專題九生物技術(shù)與工程[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)與PCR技術(shù)相關(guān)的生物學(xué)科素養(yǎng)主要體現(xiàn)角度：1．生命觀念主要體現(xiàn)(1)物質(zhì)與能量觀：PCR擴增目的基因需要模板、原料并消耗能量。(2)結(jié)構(gòu)與功能觀：PCR儀、微量移液管、微量離心管等的使用以及注意事項。2．科學(xué)思維主要體現(xiàn)(1)歸納與概括：比較PCR技術(shù)和DNA體內(nèi)復(fù)制的異同。(2)分析與推理：PCR技術(shù)中引物的選取。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)3．科學(xué)探究主要體現(xiàn)(1)實驗操作能力：探究DNA片段的擴增及電泳實驗中PCR反應(yīng)體系的配方的配制以及實驗流程中的動手操作能力。(2)實驗現(xiàn)象的觀察、分析能力：對DNA片段的擴增及電泳實驗結(jié)果的觀察、分析。4．社會責任主要體現(xiàn)PCR擴增的用途包括獲取目的基因、對感染疾病(核酸檢測)的診斷等。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(2023·廣東卷)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n＝10)進行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DA1基因發(fā)生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實驗?；卮鹣铝袉栴}：(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與________植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴增DA1基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備______________________。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(3)轉(zhuǎn)化后，T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖1)，用于后續(xù)驗證突變基因與表型的關(guān)系。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了________。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約________%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽性植株________(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達到________%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進行突變檢測，相關(guān)信息見圖2，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)解析：(1)根據(jù)題干信息可知，突變后的基因為隱性基因，則野生型DA1基因為顯性基因，因此采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。(2)利用PCR技術(shù)擴增DA1基因后，應(yīng)該用同種限制性內(nèi)切酶核酸對DA1基因和運載體進行切割，再用DNA連接酶將兩者連接起來；在基因表達載體中，啟動子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端，因此為確保插入的DA1基因可以正常表達，其上下游序列需具備啟動子和終止子。(3)①根據(jù)題干信息和圖形分析，將T0代植株的花序浸沒在農(nóng)桿菌(TDNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)液中轉(zhuǎn)化，再將獲得的T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基(含有卡那霉素)上，若在選擇培養(yǎng)基上有能夠萌發(fā)并生長的陽性個體，[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)則說明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因組中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株都含有DA1基因，由于TDNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點，所以不確定是單一位點插入還是多位點插入，若是單一位點插入，相當于一對等位基因的雜合子，其自交后代應(yīng)該出現(xiàn)3∶1的性狀分離比，而題干要求選出單一位點插入的植株，因此應(yīng)該選擇陽性率約75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將以上獲得的T2代陽性植株自交，再將得到的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，若某培養(yǎng)基上全部為具有卡那霉素抗性的植株即為需要選擇的植株，即陽性率達到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)圖形分析，野生型和突變型基因片段的長度都是150bp，野生型的基因沒有限制酶X的切割位點，而突變型的基因有限制酶X的切割位點，結(jié)合圖中的數(shù)據(jù)分析可知電泳圖中，野生型只有150bp，突變型有50bp和100bp，如圖：[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)答案：(1)野生型(2)運載體啟動子和終止子(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因②75

③自交100圖見解析[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)1．(2023·廣東梅州大埔縣虎山中學(xué)?？寄M預(yù)測)新冠病毒的抗原性與感染性與其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相關(guān)，現(xiàn)利用基因工程的方法生產(chǎn)相關(guān)疫苗。圖甲為構(gòu)建S蛋白基因表達載體的過程，圖乙為重組質(zhì)粒被相關(guān)酶切后的電泳結(jié)果。請回答下列問題。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(1)①過程所使用的酶為______，為保證PCR技術(shù)擴增S蛋白基因正常進行，該反應(yīng)體系的主要成分有__________________________________________________________________________________________________________________。PCR技術(shù)中低溫復(fù)性的目的是__________________。(2)通過PCR技術(shù)可在cDNA分子中專一性擴增出S蛋白基因，其原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________。PCR過程經(jīng)過4次循環(huán)，需要的引物的數(shù)量是________個。(3)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒長度共2000bp，用限制酶HindⅢ及限制酶HindⅢ和BamHⅠ分別對重組質(zhì)粒進行切割并電泳，結(jié)果如圖乙所示，可推測BamHⅠ在重組質(zhì)粒上有______個酶切位點。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(4)腺病毒疫苗進入人體后，S蛋白基因利用人體細胞的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)指導(dǎo)S蛋白的合成，其過程是________________________(用文字和箭頭表示)。解析：(1)①過程是利用RNA合成DNA的過程，是逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR過程中，其反應(yīng)體系的主要成分有模板DNA、脫氧核苷酸、引物、耐高溫的DNA聚合酶；低溫復(fù)性的目的是讓引物結(jié)合到互補DNA鏈。(2)由于在PCR技術(shù)中引物是根據(jù)S蛋白基因的一段已知序列設(shè)計合成的，所以能夠?qū)Ｒ恍缘臄U增出S蛋白基因。PCR技術(shù)大量擴增目的基因時，緩沖液中需要加入的引物個數(shù)計算公式為2n＋1－2，因此若一個該DNA分子在PCR儀中經(jīng)過4次循環(huán)，需要24＋1－2＝30個引物。(3)用HindⅢ將質(zhì)粒2000bp切割后形成了形成了200bp、400bp和1400bp共3個片段，而用HindⅢ和BamHⅠ將質(zhì)粒切割后形成[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)了200bp、420bp、560bp的片段，2000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6個片段，因此有5個酶切位點，因此BamHⅠ在重組質(zhì)粒上有5－2＝3個酶切位點。(4)腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗中決定S蛋白產(chǎn)生的為cDNA，S蛋白的產(chǎn)生包括以DNA的一條鏈為模板合成mRNA的轉(zhuǎn)錄過程和以mRNA為模板合成蛋白質(zhì)的翻譯過程，其過程如下：S蛋白的cDNA→轉(zhuǎn)錄→mRNA→翻譯→蛋白。答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶模板DNA、脫氧核苷酸、引物、耐高溫的DNA聚合酶引物結(jié)合到互補DNA鏈(2)引物是根據(jù)S蛋白基因的一段已知序列設(shè)計合成的30(3)3(4)S蛋白的cDNA→轉(zhuǎn)錄→mRNA→翻譯→蛋白[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)2．(2023·廣東統(tǒng)考模擬預(yù)測)DNA條形碼相當于物種的身份證，是利用短的標準DNA片段對物種進行快速鑒定的新技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)新物種、保護野生動物、監(jiān)督外來入侵物種等方面有重要作用。該技術(shù)的主要步驟為提取樣本DNA、PCR擴增、產(chǎn)物測序及序列比對，最后將結(jié)果提交至DNA序列數(shù)據(jù)庫。線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COXⅠ)被公認為動物DNA標準條形碼片段并得到廣泛應(yīng)用。(1)如何判斷兩個生物是否為同一物種？___________________________________________________________________________________________________。但該方法不適用于只能進行無性生殖的生物，DNA條形碼正好可彌補這一缺陷。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(2)采用稀釋涂布平板法和平板劃線法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)獲得單菌落，最終通過觀察菌落的____________等特征來進行初步的物種鑒定。(3)已知某種動物COXⅠ基因單鏈的核苷酸序列(虛線處省略了部分序列)為5′—GGTCAACAA…TGAAGTTTA—3′，利用PCR擴增COXⅠ基因時所需的引物序列為(已知引物的長度為9個核苷酸)________________________________和_________________________，所需的酶為______________________________，該酶在實際PCR過程中的最適溫度為________。(4)擴增得到的PCR產(chǎn)物在測序之前一般先通過________對產(chǎn)物進行初步鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________________________________等有關(guān)，加樣之前需要將PCR產(chǎn)物與______________________________________________________________________________________________________混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)解析：(1)能夠在自然狀態(tài)下相互交配并且產(chǎn)生可育后代的一群生物稱為一個物種，不同物種間一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能產(chǎn)生可育的后代。(2)采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)獲得單菌落。一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，通過觀察菌落的形狀、大小和顏色等特征可初步進行物種鑒定。(3)由于子鏈合成的方向是從子鏈的5′端向3′端延伸，引物選擇如箭頭所示，

，根據(jù)堿基互補配對原則，引物為5′—GGTCAACAA—3′和5′—TAAACTTCA—3′。PCR不需要DNA解旋[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)酶，但需要耐高溫的DNA聚合酶，該酶在實際PCR過程中的最適溫度為72℃。(4)瓊脂糖凝膠電泳可對DNA分子進行鑒定，也可實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。電泳過程中不同DNA分子產(chǎn)生的不同的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，加樣之前需要將PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)，凝膠載樣緩沖液中的指示劑可以顯示電泳過程，以便適時終止電泳。答案：(1)能相互交配且能產(chǎn)生可育后代，則為同一物種；若不能交配或交配后不能產(chǎn)生可育后代，則為不同物種(2)形狀、大小和顏色[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(3)5′－GGTCAACAA－3′

5′－TAAACTTCA－3′耐高溫的DNA聚合酶72℃(4)瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)3．(2023·廣東一模)表面展示技術(shù)是通過重組DNA技術(shù)，將外源蛋白與細胞表面的蛋白質(zhì)組裝成融合蛋白，從而可展示在細胞表面?；卮鹣铝袉栴}。(1)若要將芽孢表面蛋白基因cotB與外源的綠色熒光蛋白基因gfp構(gòu)建成基因表達載體，下圖中最適合通過綠色熒光(綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光)確定融合蛋白成功表達的是____。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)注：Ampr為氨卡青霉素抗性基因；→表示轉(zhuǎn)錄方向；UAG，UAA，UGA是終止密碼子，AUG是起始密碼子。(2)芽孢表面蛋白是實現(xiàn)表面展示技術(shù)的關(guān)鍵蛋白，結(jié)合上述材料，試分析該蛋白在表面展示技術(shù)中的作用是________________________________________________________________________________________________________。(3)導(dǎo)入基因表達載體后的芽孢桿菌接種在含有____________的固體培養(yǎng)基上，以獲得攜帶載體的單菌落，該過程被稱為微生物的____培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)基中可能既有含基因表達載體的單菌落，也有含________的單菌落，因此還需要對DNA進行提取，常用酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)，這里酒精的作用原理是___________________________________________________________________。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(5)若要確定表面展示技術(shù)在芽孢桿菌上構(gòu)建成功，應(yīng)在紫外光環(huán)境下對其進行______水平的檢測。解析：(1)若要將芽孢表面蛋白基因cotB與外源的綠色熒光蛋白基因gfp構(gòu)建成基因表達載體，則需要將cotB和gfp一起表達，即使用一個啟動子和終止子，并且cotB在前，gfp在后，才能通過綠色熒光(綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光)確定融合蛋白成功表達，為了能夠順利表達gfp則中間不能出現(xiàn)終止密碼子，轉(zhuǎn)錄時模板鏈的方向應(yīng)是3′到5′，D中mRNA中間會出現(xiàn)終止密碼。只有C項符合題意，C項正確。(2)蛋白在表面展示技術(shù)中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在細胞表面的，在與外源蛋白形成融合蛋白后，可將外源蛋白展示(定位在芽孢桿菌表面)。(3)由于表達載體中含有Ampr基因，則若轉(zhuǎn)基因[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)成功能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，所以可以將芽孢桿菌接種在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，以獲得攜帶載體的單菌落，該過程被稱為微生物的選擇培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)基中可能既有含基因表達載體的單菌落，也有含空載體(不含目的基因的載體、不含外源基因的載體)的單菌落，因此還需要對DNA進行提取，然后進行鑒定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，所以可以用酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)。(5)由于綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光，所以可在紫外光環(huán)境下對芽孢桿菌進行個體(細胞)水平進行檢測。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)答案：(1)C(2)芽孢表面蛋白是可以定位在細胞表面的，在與外源蛋白形成融合蛋白后，可將外源蛋白展示/定位在芽孢桿菌表面(3)氨芐青霉素/Amp選擇(4)空載體(不含目的基因的載體、不含外源基因的載體)

DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精(5)個體/細胞[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)4．(2023·廣東一模)中國科學(xué)家采集了某深海海域的沉積物樣品，分離、鑒定得到其中的深海放線菌，以期獲得具有前景的抗生素替代品。據(jù)此回答下列問題：(1)研究人員欲篩選出深海放線菌進行研究，取1g沉積物樣品接種在液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，稀釋后取菌液通過__________法接種到高氏一號(加數(shù)滴質(zhì)量分數(shù)為10%的酚)培養(yǎng)基表面以獲得單菌落。培養(yǎng)基中的酚能抑制細菌等雜菌的生長，而放線菌能在該培養(yǎng)基上正常生長，這種培養(yǎng)基屬于__________(填“選擇”或“鑒別”)培養(yǎng)基。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(2)通過PCR技術(shù)擴增分離得到的放線菌的16SrRNA基因可進行菌株的種屬鑒定。PCR技術(shù)中起關(guān)鍵作用的酶是__________。該技術(shù)能在放線菌總的DNA中專一性擴增出16SrRNA基因的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。PCR產(chǎn)物一般可通過__________鑒定。(3)紫色桿菌的紫色菌素(一種毒素，致死率高)能使培養(yǎng)基呈紫色，已知呋喃酮C30能明顯抑制紫色菌素的產(chǎn)生。研究人員篩選出了放線菌菌株A，用甲醇將菌株A發(fā)酵產(chǎn)物提取后配制成溶液，對提取物能否抑制紫色菌素的產(chǎn)生進行了研究。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)①將紫色桿菌菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面，待菌液干燥后，將無菌圓紙片貼于培養(yǎng)基表面，按圖1所示在濾紙片上滴加溶液。該實驗以__________組為對照，通過比較A、B、C三組的__________可知提取物是否能抑制紫色菌素的產(chǎn)生。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)②實驗表明甲醇溶液不會影響紫色桿菌的繁殖，培養(yǎng)過程中對A、B、C三組紫色桿菌的數(shù)量進行監(jiān)測，結(jié)果如圖2所示，據(jù)圖推測，深海放線菌A的提取物作為抗生素替代品的優(yōu)點是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)分離和純化微生物常用的方法是平板劃線法和稀釋涂布平板法，題干信息提示菌液已經(jīng)先經(jīng)過稀釋，推知這里的接種方法是稀釋涂布平板法。該培養(yǎng)基允許放線菌生長，同時抑制或阻止其他細菌等雜菌的生長，推知該培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基。(2)PCR技術(shù)的變性(90℃以上)、復(fù)性(50℃左右)、延伸(72℃左右)階段需要的溫度都比較高，所以需要耐高溫的DNA聚合酶。引物是[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)一段能與DNA母鏈部分堿基互補配對的短單鏈核酸，因此能特異性擴增出目的基因片段，該PCR中引物能與16SrRNA基因特異性結(jié)合，因此能在放線菌總的DNA中專一性擴增出16SrRNA基因。PCR擴增的產(chǎn)物是DNA分子，DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH條件下，這些基團可以帶上正電荷或者負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶的電荷相反的電極移動，因此PCR產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。(3)①研究提取物的作用時，一般需要設(shè)置空白對照和陽性對照。由題干可知呋喃酮C30能明顯抑制紫色菌素的產(chǎn)生，推知陽性對照滴加5μL呋喃酮C30，而菌株A發(fā)酵產(chǎn)物通過甲醇提取，推知空白對照滴加5μL甲醇溶液，即該實驗以A、C組為對照。由于紫色菌素使得培養(yǎng)基呈紫色，若提取物能抑制紫色菌素產(chǎn)生，則會產(chǎn)生褪色[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)圈(透明圈)，根據(jù)褪色圈的直徑即可推知其抑制作用大小。②由圖1可知，滴加呋喃酮C30和菌株A提取物后，紫色桿菌的數(shù)量與空白對照組(滴加甲醇溶液)差別不大，推知提取物不會影響致病菌的生長，但是致病菌產(chǎn)生的紫色菌素卻有區(qū)別，推知提取物不會對致病菌進行選擇，使得其不會產(chǎn)生耐藥性。答案：(1)稀釋涂布平板/涂布平板選擇(2)耐高溫的DNA聚合酶引物能與16SrRNA基因特異性結(jié)合/引物是根據(jù)16SrRNA基因一段已知序列設(shè)計合成的瓊脂糖凝膠電泳(3)①A、C褪色(透明)圈直徑②不會影響致病菌的生長，從而不會脅迫致病菌使其產(chǎn)生耐藥性/不易對致病菌形成選擇壓力而導(dǎo)致其產(chǎn)生耐藥性[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)5．(2023·廣東一模)β-丙氨酸作為重要的中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。L-天冬氨酸-α-脫羧酶(PanD)能夠催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力)較低且易失活。研究人員運用蛋白質(zhì)工程對酶基因進行分子改造，在未知PanD三維結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的情況下，通過易錯PCR技術(shù)引入隨機突變，再進行定向篩選，最終獲得活力和穩(wěn)定性均較高的PanD?；卮鹣铝袉栴}。(1)易錯PCR與普通PCR相似，每次循環(huán)也包括了_______________三步，但可通過改變PCR反應(yīng)條件來提高堿基錯配的幾率。在PCR反應(yīng)體系中，Mg2＋可以提高已發(fā)生錯配區(qū)域的穩(wěn)定性，Mn2＋可以降低DNA聚合酶對底物的專一性。因此，與普通PCR相比，易錯PCR的反應(yīng)體系中應(yīng)適當______(填“提高”或“降低”)Mg2＋濃度、______(填“提高”或“降低”)Mn2＋濃度。通過多輪的易錯PCR及篩選，可以獲取所需的PanD基因。[高考命題熱點十]熒光定量PCR技術(shù)(2)研究人員對比改造前后的兩種PanD，發(fā)現(xiàn)改造后的PanD的第305位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸，推測突變后酶活力升高的原因是______________________