土壤宏基因組的研究進展

loading12%16%18%21%26%42%52%52%63%78%96%100%土壤宏基因組學的研究方法與進展1.什么是宏基因組學2.宏基因組學的基本

技術3.宏基因組學的應用和研究進展主要內(nèi)容宏基因組學宏基因組1998年，HandelsmanJ等在前人研究的基礎上，正式提出了宏基因組的概念，其定義為：Thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature，即生境中全部微小生物遺傳物質的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物即環(huán)境樣品中的所有細菌和真菌的基因。宏基因組學(metagenomics)宏基因組學（Metagenomics）又叫環(huán)境基因組學（EnvironmentalGenomics）或群體基因組學（CommunityGenomics）。利用非培養(yǎng)的分子生物學技術、方法和手段對宏基因組進行系統(tǒng)研究。研究手段：功能基因篩選和測序研究對象：環(huán)境樣品中的微生物群體基因組研究目的：微生物多樣性、種群結構、進化關系；基因功能活性、相互協(xié)作關系及基因表達與環(huán)境之間的關系宏基因組學土壤微生物宏基因組學環(huán)境微生物數(shù)量巨大、種類繁多。據(jù)估計，每1g土壤樣品含有約1000種不同的微生物

，有2000種微生物基因型，每種基因型出現(xiàn)的幾率為0.05%，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從環(huán)境中只能獲得1%左右的微生物。土壤宏基因組學技術是近來發(fā)展比較迅速的一種新方法，這種方法從土壤環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組DNA即宏基因組。特點：采取非培養(yǎng)方法，繞過微生物菌種分離培養(yǎng)這一技術難關，使從研究環(huán)境中獲得大量未能培養(yǎng)的微生物成為現(xiàn)實，直接在基因水平上研究、開發(fā)和利用無法培養(yǎng)的微生物資源，為人類開發(fā)利用自然環(huán)境中微生物基因資源開辟了新的途徑。宏基因組學宏基因組學的發(fā)展概況為了獲得完整的環(huán)境微生物基因表達產(chǎn)物，早在1978年許多學者就提出了直接從環(huán)境中提取微生物DNA的思路；1991年，Pace等直接提取浮游生物群體的總DNA，克隆到E.coli中構建環(huán)境DNA文庫，初步證明從環(huán)境中克隆生物體基因的可行性；1995年，Healy等通過構建了微生物混合培養(yǎng)物的基因組文庫，最終篩選到了相關功能降解酶類；1996年，Stein等通過構建海水中原核微生物基因組文庫篩選到了1個含有以前從未培養(yǎng)過的古菌16SrRNA基因的克??；1998年，Handelsman等正式提出宏基因組的概念并創(chuàng)立宏基因組學。從誕生至今僅有十多年時間，但已引起了世界的廣泛關注，成為各國研究的熱門領域。1.什么是宏基因組學2.宏基因組學的基本

技術3.宏基因組學的應用和研究進展主要內(nèi)容宏基因組學的基本技術宏基因組文庫構建流程從土壤環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組DNA并克隆于不同載體，再將重組載體轉移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫。同時結合不同的篩選技術，從基因文庫中篩選新基因或新的生物活性物質。提取宏基因組DNA連接到合適的載體上轉化宿主菌形成宏基因組文庫篩選宏基因組文庫宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析宏基因組學的基本技術1土壤DNA的提取和純化2宏基因組文庫的構建及篩選3宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析1、土壤DNA的提取和純化

土壤DNA的提取土壤樣品的采集是宏基因組文庫構建的關鍵的一步，采樣需遵循操作規(guī)程，采取具有代表性的樣品，縮短運輸和保存的時間，使樣品能更好地代表自然狀態(tài)下土壤微生物的原貌。土壤微生物往往會與土壤中的其他組分緊密結合，環(huán)境樣品中都含有的雜質(如腐殖酸類物質)，會抑制分子克隆中多種酶的活性。文庫的構建需要足夠的高質量的DNA，環(huán)境樣品DNA提取提取通常需要滿足兩個條件：12盡可能提取樣品所有微生物的基因保持一定的DNA片段長度、完整性和純度1、土壤DNA的提取和純化

12直接提取法間接提取法DNA的提取純化方法1、土壤DNA的提取和純化

直接提取法又稱原位提取法：在環(huán)境樣品中加入DNA提取緩沖液，直接破碎土壤中的微生物細胞而使DNA釋放，提取DNA并純化的方法。手段：物理法（凍融法、超聲法、玻璃球珠擊打法、液氮碾磨法）、化學法（常用化學試劑有表面活性劑、鹽類、有機溶劑等）、酶裂解法（加入裂解酶、蛋白酶K和溶解酶等）。優(yōu)點：該法提取的DNA產(chǎn)量較高，易操作、成本低，所得DNA更能代表土壤微生物的組成；缺點：純度低，腐植酸等污染嚴重，還需要經(jīng)過純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學操作的需要。此外，由于機械剪切作用較強，提得的DNA片段長度有限（1-50Kb），常適用于構建小片段插入文庫（以質粒和噬菌體為載體）的DNA提取。1、土壤DNA的提取和純化

間接提取法又稱異位提取法：是先采用物理方法將微生物細胞從土壤中分離出來，然后采用較溫和的方法抽提DNA并純化。優(yōu)點：純度高，提取得到的DNA片段長度相對較長（20-500Kb），適合構建黏粒（cosmid）文庫和細菌人工染色體（BAC）文庫。缺點：操作繁瑣、得率低、成本高，且溫和條件下一些細胞壁較厚的微生物DNA抽提不出來。獲得的DNA產(chǎn)率只是直接裂解法的1%~10%，獲得的DNA往往不能完全代表樣品所在生境的生態(tài)學多樣性。高質量DNA的純化純化方法：通常采用氯化銫密度梯度超速離心，

色譜法，

電泳法，透析和過濾法等方法進行純化，任何一種方法都不可以完全去掉樣品中的污染物，需要用兩種或兩種以上的純化方法。宏基因組學的基本技術1土壤DNA的提取和純化2宏基因組文庫的構建及篩選3宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析2、宏基因組文庫的構建及篩選載體的選擇載體系統(tǒng)的選擇取決于所提取土壤DNA的質量及研究目的，需要考慮：欲插入目的片段的大小所需要的載體拷貝數(shù)使用的宿主篩選方法如對腐殖質含量較高或剪切較嚴重的DNA樣品適宜構建質粒文庫。小片段的文庫適用于篩選新的與代謝相關的單基因或小操縱子。含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構建大片段和大容量的載體。大的質粒一般轉化效率低。但選擇能插入大片斷的載體對于開發(fā)微生物活性物質卻是很有必要，因為大部分微生物的代謝途徑是由多基因族控制的。2、宏基因組文庫的構建及篩選載體的選擇可用于構建宏基因組文庫的載體很多，常用的克隆載體包括質粒（plasmid）、柯斯載體（cosmid）、福斯質粒（fosmid）和細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）等。載體的選擇要有利于目的基因的擴增、表達及在篩選細胞中目標物質的表達量的調控等。根據(jù)插入片斷大小，可以把基因文庫分成兩類：質粒CosmidBAC插入片段超過100kb插入片段30～45kb插入片段小于10kb例：用于研究抗生素或復雜的基因簇，選擇BAC載體。BAC載體能克隆100kb以上的大插入片斷，完全有可能克隆到完整的代謝基因簇途徑，但是其拷貝數(shù)目和表達量低。2、宏基因組文庫的構建及篩選宿主系統(tǒng)

的選擇在構建文庫的過程中，細菌、酵母、鏈霉菌等為主要的宿主。不同的宿主所產(chǎn)生的活性物質有明顯的差異，目前構建的文庫如果篩選新的酶，采用大腸桿菌為宜；若是抗菌抗腫瘤物質，選擇鏈酶菌為宿主較為理想。宿主菌株的選擇主要考慮：轉化效率1重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性2宿主能否提供必需的轉錄表達體系3對異源表達基因產(chǎn)物是否有較強的相容性4目標性狀(如抗菌性)5缺陷型62、宏基因組文庫的構建及篩選酶切與酶連將提取的土壤總DNA用四堿基識別位點限制性內(nèi)切酶隨機切割，由于理論上酶切位點分布均勻，因此可以近似認為切割是隨機和均勻的。酶切時DNA濃度不可過高，否則酶切可能會遇到困難。酶切后分離目的長度片段與載體相連接，獲得的酶連產(chǎn)物準備轉化。2、宏基因組文庫的構建及篩選轉化在宏基因組克隆中，所謂轉化是指通過適當?shù)姆椒ㄊ顾拗骷毎幱诟惺軕B(tài)，從而攝取重組DNA的水平方向的基因轉移過程。其方法有：

CaCl2法CaCl2法即用高濃度的Ca2+誘導細胞使其成為能攝取外源DNA的感受狀態(tài)，該方法自建立以來已廣泛用于以大腸桿菌為受體的重組質粒的轉化，但該方法轉化效率不高。電穿孔法

電穿孔法是用高壓脈沖電流擊破宿主細胞膜或擊成小孔，從而使外源DNA由小孔進入細胞，該方法轉化效率較高。2、宏基因組文庫的構建及篩選1化合物結構水平的篩選2功能驅動篩選3序列驅動篩選4底物誘導基因表達篩選土壤中的微生物種類繁多，因此構建的文庫容量較大，所以要根據(jù)研究目標的不同進行篩選。土壤宏基因文庫的篩選除了直接篩選的方法以外，還主要有：2、宏基因組文庫的構建及篩選化合物結構水平的篩選化合物結構水平的篩選（Screeningoncompoundstructure）是根據(jù)不同結構的物質在色譜中有不同的吸收峰值，通過比較轉入和未轉入外源基因的宿主細胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，篩選產(chǎn)生新結構化合物的克隆子。這一方法可直接篩選到新結構化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。2、宏基因組文庫的構建及篩選功能驅動的篩選功能驅動的篩選（Function-drivenscreening）即基于活性的篩選。是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性而進行篩選的方法。在工業(yè)上有很多重要的酶就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。2、宏基因組文庫的構建及篩選功能驅動的篩選方法：對具有特殊功能的克隆子進行直接檢測，如利用其在選擇性培養(yǎng)基上的表型特征進行篩選；優(yōu)點：只要基因能在宿主中表達，就可以根據(jù)基因表達特性進行篩選，能迅速找到可用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的酶等蛋白質和抗生素等天然產(chǎn)物；缺點：目的基因必須能在宿主中進行功能表達，而基因表達與否除了和宿主有關外，還決定于基因本身的完整性，這就要求一方面要選擇合適的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全長，一但克隆過程中基因的某個組件遭到破壞將使基因無法表達，也就不能根據(jù)表型加以篩選。篩選工作量大、效率低。2、宏基因組文庫的構建及篩選序列驅動的篩選序列驅動的篩選（Sequence-drivenscreening）是根據(jù)已知功能的基因序列設計探針或PCR引物，通過核酸雜交尋找目的基因或直接對目的基因進行擴增。優(yōu)點：不依賴克隆基因在宿主菌株中的表達。缺點：于必須首先知道相關基因的序列，以設計合適的探針或PCR引物。無法篩選宏基因組文庫中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的新基因，即未知的基因。2、宏基因組文庫的構建及篩選底物誘導的篩選原理：代謝相關基因或酶基因往往在有底物存在的條件下才表達，反之則不表達。底物誘導的篩選（Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX）是利用合適的底物進行誘導，使克隆子分解代謝基因表達來進行篩選的方法。用于克隆宏基因組DNA的表達載體下游包含有一個gfp（綠色熒光蛋白）基因。通過構建lac啟動子gfp質粒載體，在底物誘導下，使目的DNA與gfp共表達，借助熒光激活的細胞分揀技術（Fluorescenceactivatedcellsorting，F(xiàn)ACS）進行篩選。2、宏基因組文庫的構建及篩選SIGEX載體特點一種操作子捕獲（operontrap）載體含有一個標記基因（如gfp），能夠與受底物誘導的操作子基因片段共表達穩(wěn)定性好標記基因前有自身可誘導啟動子，能夠檢測自連的載體標記基因前有核糖體接合位點（RBS）位點和起始密碼子，避免形成融合蛋白2、宏基因組文庫的構建及篩選底物誘導的篩選這個方法的基本過程主要有4步:構建lac啟動子gfp質粒載體，克隆位點將Lac啟動子和gfp結構基因分開；以異丙基2-β-2-D-硫代半乳糖苷（IPTG）為誘導物去除自連接的陰性克??；在培養(yǎng)基中添加底物誘導代謝相關基因的表達；根據(jù)gfp基因的表達從宏基因克隆庫中篩選出表達代謝基因的克隆子，從瓊脂培養(yǎng)平板上將gfp表達的克隆子分離出來。2、宏基因組文庫的構建及篩選優(yōu)點以底物推斷出未知的酶，進而推斷基因的功能，篩選到新的代謝相關基因誘導底物不需要經(jīng)過特殊修飾避免了引入酶切位點的麻煩和切斷目的基因的可能結合流式細胞術，適于高通量克隆和篩選2、宏基因組文庫的構建及篩選缺點不能篩選組成型表達的基因插入片段帶有自身啟動子對目標基因的結構性和適應性很敏感載體容量有限，>10kb的基因或操縱子難以克隆僅針對能進入細胞質的底物某些基因的表達不僅受底物誘導，還可受其他因子的誘導；某些基因無需誘導即能表達與GFP反向插入的目的基因、目的基因與gfp之間有轉錄終止子的情況將漏檢FACS（熒光激活細胞分揀術）對進樣設備的要求也比較高2、宏基因組文庫的構建及篩選在實際工作中，序列驅動和功能驅動也可以結合使用。例如，陳旭玉等先用特異的引物對土壤宏基因組文庫進行PCR篩選，再進一步通過功能篩選，得到了兩個對稻瘟菌有明顯抑制作用的克隆子。此外，一些新的方法如微陣列技術(microarray)、穩(wěn)定性同位素標記技術(stableisotopeprobing，SIP)、熒光原位雜交技術(fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH)也已用于篩選和鑒定文庫中的有用基因。宏基因組學的基本技術1土壤DNA的提取和純化2宏基因組文庫的構建及篩選3宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析3、宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析宏基因組測序從環(huán)境樣品中提取的DNA也可用于測序，以考察微生物群落結構、功能、代謝調節(jié)、進化及其與各種環(huán)境因子的關系。第二代測序技術

將片斷化的基因組DNA兩端連上特殊的接頭通過不同的方式將每個片段結合在微珠或芯片上，形成幾百萬個可以同時進行反應的微型反應池每個單鏈DNA片段在其微型反應池中通過PCR擴增產(chǎn)生大量拷貝形成單克隆“DNA簇群”（Polony）以作為測序的模板通過酶延伸反應或寡核苷酸連接反應同時對這幾百萬個微型反應池中的模板進行測序。由于序列片段較短，環(huán)境樣品通常具有高度的復雜性，第二代測序主要的問題也就在于數(shù)據(jù)處理困難。3、宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析宏基因組的數(shù)據(jù)處理包括序列拼接和基因征集（genecalling），接下來分析生物多樣性，進行基因注釋；在此基礎上，可以獲得一些重要的宏基因組信息，如序列組成（GC含量、基因組大小等）

、物種組成、功能組成和群落特征等。歸類：根據(jù)相似度或序列組成對序列進行歸類（binning），即將樣品序列歸到正確的類或OUT（分類系統(tǒng)要求）。以與其來源聯(lián)系起來。基于相似度的方法將序列與數(shù)據(jù)庫比較，然后依據(jù)相似度來對序列歸類。這類方法的一個缺陷是依賴于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫，而環(huán)境中絕大多數(shù)微生物的序列仍是未知，因此宏基因組數(shù)據(jù)中最多可達90%的序列由于缺乏參考序列而不能被鑒定。基于組成的方法則是分析序列自身的特征，如GC含量、密碼子使用率或寡核苷酸頻率。3、宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析目前，測序的報道鮮見，主要的障礙在于序列的拼接；而針對特定目標片段（某些功能基因）的大規(guī)模測序，已經(jīng)有了相當多的研究。rDNA序列分析16S和18SrDNA分別編碼原核生物和真核生物核糖體小亞基RNA分子，由于其高度的保守性，長期以來被用于分析物種間的親緣關系和物種多樣性。通常先提取土壤總DNA，再利用通用引物擴增16S或18SrDNA，建庫后測序，根據(jù)16S或18SrDNA序列分析系統(tǒng)發(fā)育關系和生物多樣性。大尺度DNA測序大尺度DNA測序既可以是獲得大規(guī)模的特定功能基因的序列；也可以是將所得到的環(huán)境DNA全部測序，以考察群落的物種組成和基因組成，明確群落的結構和功能及其與環(huán)境間相互關系。3、宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析雜交或微列陣方法熒光原位雜交技術基本原理是用熒光標記的寡核苷酸探針特異地和互補核酸序列(如16S/18SrDNA或其他基因)結合，然后通過檢測熒光信號可以對目標DNA進行定性或定量分析，以反映微生物組成及功能。具體過程包括以下幾步:①樣品固定②預處理樣品③用相應的探針進行雜交④洗掉未結合的探針⑤封固、呈像及結果分析微列陣技術，又稱基因芯片，是一種重要的生物芯片。它也是采用核酸分子雜交的工作原理，應用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，然后通過信號檢測對樣品（如宏基因組）進行定性或定量分析。通過設計特定的探針與環(huán)境樣品中的核酸進行雜交來考察其中目的基因。1.什么是宏基因組學2.宏基因組學的基本

技術3.宏基因組學的應用和研究進展主要內(nèi)容宏基因組學的應用和研究進展宏基因組學的應用和研究進展宏基因組學在土壤微生物研究中的應用：16SrRNA序列的PCR擴增、測序建立微生物區(qū)系的16SrRNA/DNA文庫，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，建立進化樹，進行種群分布分析從而獲得微生物多樣性信息，經(jīng)行細菌的分類和進化分析。對微生物及其基因資源進行篩選，開發(fā)利用具有應用潛力的基因。宏基因組DNA提取去除污染,接頭序列種群分布分析不同生境下種群的比較分析高通量測序組學系統(tǒng)分析高通量基因克隆宏基因組學的應用和研究進展宏基因組學在土壤微生物研究中的的應用：J.CraigVenter等用鳥槍法獲得了大量的宏基因組序列，并對其進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)了1800種基因組，其中148個屬于全新的細菌門類，其中120萬個是新基因。揭示土壤微生物的多樣性及其與環(huán)境之間的關系土壤宏基因組學技術為研究土壤微生物復雜群落結構提供了重要工具。通過對基因組文庫中的16SrRNA基因序列的系統(tǒng)化研究，使環(huán)境