作物育種學總論 第十四章 分子標記輔助選擇育種課件

第十四章分子標記與作物育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

緒

分子標記輔助選擇(MAS)的主要進展

1.基因聚合(genepyramiding)2.基因轉移(genetransfer)3.數(shù)量性狀的MAS作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種第一節(jié).分子標記的類型和作用原理遺傳標記（geneticmarker）:指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性；因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種遺傳標記的類型形態(tài)學標記（morphologicalmarker）細胞學標記(cytologicalmarker)生化標記(biochemicalmarker)分子標記(molecularmarker)：DNA分子遺傳標記，或DNA標記。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種即植物的外部形態(tài)特征。主要包括肉眼可見的外部特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關的一些特性。

優(yōu)點：形態(tài)標記簡單直觀、經(jīng)濟方便；

缺點:(1)數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的;(2)且多態(tài)性較差，表現(xiàn)易受環(huán)境影響，(3)有一些標記與不良性狀連鎖。(4)形態(tài)標記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。因此形態(tài)標記在作物遺傳育種中的作用是有限的。形態(tài)標記作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

即植物細胞染色體的變異：包括染色體核型（染色體數(shù)目、結構、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。與形態(tài)標記相比，細胞學標記的優(yōu)點是能進行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。但細胞學標記材料需要花費較大的人力和較長時間來培育，難度很大；同時某些物種對染色體變異反應敏感；還有些變異難以用細胞學方法進行檢測。因此到目前為止，真正應用于作物遺傳育種研究中的細胞學標記還很少。細胞學標記作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

主要包括同工酶和等位酶標記。同工酶是：指結構不同、功能相似的酶，也即具有同一底物專一性的不同分子形式的酶。屬于一個以上基因座位編碼的酶的不同形式；而等位酶是指由一個基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。分析方法是從植物組織的蛋白粗提物中通過電泳和組織化學染色法將酶的多種形式轉變成肉眼可辯的酶譜帶型。生化標記作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種與形態(tài)標記、細胞學標記相比，生化標記具兩個方面的優(yōu)點：一是表現(xiàn)近中性，對植物經(jīng)濟性狀一般沒有大的不良影響；二是直接反映了基因產物差異，受環(huán)境影響較小。但目前可使用的生化標記數(shù)量還相當有限，且有些酶的染色方法和電泳技術有一定難度，因此其實際應用受到一定限制。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種一、分子標記標記的類型和特點作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種目前的分子標記類型第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術，包括RFLP、DNA指紋技術（DNAFingerprinting）等；第二類是以PCR為核心的分子標記技術，包括RAPD、簡單序列重復標記SSR、序標位STS、序列特征化擴增區(qū)域SCAR等；第三類是一些新型的分子標記，如：SNP標記、表達序列標簽EST標記等。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種分子標記的特點：

（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定（2）數(shù)量多（3）多態(tài)性高（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；（5）許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。（6）成本不太高作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種二、分子標記的原理和遺傳特性(一)RFLP標記1.RFLP標記的原理植物基因組DNA上的堿基替換、插入、缺失或重復等，造成某種限制性內切酶酶切位點的增加或喪失，從而產生限制性片斷長度多態(tài)性。

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種基本步驟用DNA限制性內切酶消化Southern雜交

放射性自顯影或酶學檢測

DNA提取凝膠電泳分離，轉移到濾膜上作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種2）特點A無表型效應，RFLP標記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。BRFLP標記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。C在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應，因而互不干擾DRFLP標記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制EDNA需要量大，檢測技術繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中。在植物分子標記輔助育種中需要將RFLP轉換成以PCR為基礎的標記。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種PCR-basedmarkersPCR:polymerasechainreaction（多聚酶鏈式反應）amplificationoftractsofDNAdefinedbybordersequencesthathybridizetoselectedDNApolymeraseprimersRequires:-targetDNA-thermostableDNApolymerase(Taq)-oligonucleotideprimer(s)(7-30nt)-dNTPs+Mg++作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種（二）RAPD標記1.RAPD標記原理作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種RAPD標記的主要特點有：（1）不需DNA探針，設計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實驗重復性較差，結果可靠性較低。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種（三）AFLP1.原理作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種2.AFLP標記的主要特點有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術所產生的標記數(shù)目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應產物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結果可靠；（5）目前該技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。但也存在假陽性帶出現(xiàn)頻繁、技術復雜、成本高等缺點。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種（四）SSR1.原理作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種SSR標記的主要特點有：（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好，結果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費用也較高。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種英文縮寫英文名稱中文名稱RFLPRestrictionfragmentIengthpolymorphism限制性片段長度多態(tài)性STSSequencetaggedsite序列標簽位點RAPDRandomamplifiedpolymor-PhicDNA隨機擴增多態(tài)性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism擴增片斷長度多態(tài)性SSRSimplesequencerepeat簡單序列重復SNPSimplemucleotidepolymor-phism單核苷酸多態(tài)性幾種主要的ＤＮＡ分子標記作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種分子標記的遺傳基礎

標記輔助選擇的主要方面是對目標基因的選擇，有人稱之為前景選擇（foregroundselection）。前景選擇的可靠性主要取決于標記與目標基因間連鎖的緊密程度。若只用一個標記對目標基因進行選擇，則標記與目標基因間的連鎖必須非常緊密，才能夠達到較高的正確率。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種供體受體RRRrrr(1-r)22r(1-r)r2MRmrMRmr目標基因與DNA標記間的遺傳距離位p親本中DNA標記的帶型F1雜種中DNA標記的帶型在F2分離群體中分子標記類型即MM,Mm,mmMM類型的分子標記所代表的目標基因型及其頻率利用MAS的遺傳基礎（以RFLP為例）M—抗性標記R—抗性基因m—感病標記r—感病基因作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

選擇的正確率隨重組率的增加而迅速下降。重組值越小，其錯選率越低。

如果要求至少選到一株目標基因型的概率為P，則必須選擇具有標記基因型MM的植株至少為：

n＝log（1-P）/log（1-p）式中p＝（1－r）2作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

對基因組中其他部分（即遺傳背景）選擇，稱為背景選擇（backgroundselections）。背景選擇的對象幾乎包括了整個基因組，因此，這里牽涉到一個全基因組選擇的問題，在分離群體中，由于在上一代形成配子時同源染色體之間會發(fā)生交換，因此每條染色體都可能是由雙親染色體重新組裝的雜合體。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種分子標記的優(yōu)越性1.克服性狀表現(xiàn)型鑒定的困難2.允許早期選擇3.控制單一性狀的多個（等位）基因的利用4.允許同時選擇多個性狀5.可進行性狀非破壞性評價和選擇6.從育種進程考慮，可加快育種進程，提高育種效率作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種三.分子標記輔助選擇應具備的主要條件A：與目標基因緊密連鎖的分子標記B:簡便快捷的標記檢測方法作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種Howtouseageneticmarkerformarker-assistedselectionWeaverCarrierSire+WW+++M1M2M1M2M3M3W=Weaver+=Normal作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

目標基因的標記篩選（genetagging）是進行分子標記輔助選擇（MAS）育種的基礎。用于MAS育種的分子標記須具備三個條件：分子標記與目標基因緊密連鎖標記實用性強，重復性好，而且能夠經(jīng)濟簡便地檢測大量個體。不同遺傳背景選擇有效。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種第二節(jié)重要農藝性狀基因連鎖標記的篩選技術作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種一、遺傳圖譜的構建與重要農藝性狀基因的標記

遺傳作圖的原理其原理是基于染色體的交換與重組。在細胞減數(shù)分裂時，非同源染色體上的基因相互獨立，自由組合，而位于同源染色體上的連鎖基因在減數(shù)分裂前期I非姊妹染色單體間的交換而發(fā)生基因重組，用重組率來表示基因間的遺傳距離。遺傳圖譜只顯示基因間在染色體上的位置，并不反映DNA的實際長度。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種構建遺傳圖譜的主要環(huán)節(jié)：根據(jù)遺傳材料之間的多態(tài)性確定親本組合，建立作圖群體。對群體中不同植株的標記進行基因性分析。借助計算機程序構建連鎖群作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

構建遺傳圖譜，首先要選擇合適的親本及分離群體，而且親本之間的差異不宜過大，否則會降低所建圖譜的準確度和適用性。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

用于分子標記的遺傳作圖可分為兩類：暫時性分離群體，包括F2群體、BC等永久性分離群體，包括重組自交系群體、加倍單倍體群體等作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種自花授粉作物作圖群體的構建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL異花授粉作物作圖群體的構建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg雜合F1對B、D、G位點來說，相當于F2對A、C、E位點來說，相當于測交F位點不分離作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種F2BC1DHRIL群體形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化個體F2個體自交后代性狀研究對象個體個體品系品系準確度低低高高必要的群體規(guī)模大大中中分離比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作物群體的特點作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種二、近等基因系的培育與重要農藝性狀基因的標記htt作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種三、群體分離分析法與重要農藝性狀基因的標記作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種R/Rr/rRrP:F2:F1:Rr

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種抗

感雜雜雜

感雜

抗

感

雜

抗雜雜抗

感分離群體分子標記輔助選擇抗性鑒定結果作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種四、數(shù)量性狀基因的定位作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種四.影響分子標記輔助選擇(MAS)的因素

大量理論和實踐研究表明，影響MAS選擇效率的因素非常復雜，其中標記與基因(QTL)之間的距離、目標性狀的遺傳率、群體大小和性質、選用分子標記數(shù)目以及標記與基因(QTL)的連鎖相等是重要因子。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種1標記與連鎖基因(QTL)間的連鎖程度前景選擇的準確性主要取決于標記與目標基因的連鎖強度，標記與基因連鎖得愈緊密，依據(jù)標記進行選擇的可靠性就愈高。此外，重組值r也影響到由該標記位點等位基因分離產生遺傳方差的大小r值越小，遺傳方差越大，數(shù)量性狀的選擇效率越高。

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種2性狀的遺傳率

性狀的遺傳率極大地影響MAS選擇效率。遺傳率較高的性狀，根據(jù)表型就可較有把握地對其實施選擇，此時分子標記提供信息量較少，MAS效率隨性狀遺傳率增加而顯著降低。利用MAS技術所選性狀的遺傳率應在中度(0.3～0.4)會更好。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種3群體大小和性質

群體大小是制約MAS選擇效率的重要因素之一。一般情況下，MAS群體大小不應小于200個。選擇效率隨著群體增加而加大，特別是在低世代，群體連鎖不平衡性越大，MAS效率就越高。由兩個自交系雜交產生的F2群體，其連鎖不平衡性往往最大，因而其MAS效率也較高。

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種4選用分子標記數(shù)目和類型

理論上標記數(shù)越多，從中篩選出對目標性狀有顯著效應的標機會就越大，因而應有利于MAS。計算機模擬研究表明當每條染色體上標記數(shù)增加到6個以上時效率降低，最優(yōu)距離為20cM。

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沈新蓮等用2個RAPD標記和1個SSR標記進行棉花纖維強度QTL輔助選擇，比較顯性標記和共顯性標記之間純合基因型和雜合基因型之間選擇差異后，認為共顯性SSR標記(可有效地剔除雜合基因型)對以加性/隱性為主遺傳的QTL進行MAS效果會更好。

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種5顯性標記的相位

對質量性狀的選擇，無論目標基因是否顯隱性，均需選擇到純合植株，但顯性標記無法鑒定純合與否。Haley等研究菜豆普通花葉病毒隱性抗性基因，兩RAPD標記一個相引(M1，1.9cM)，另一個相斥連鎖(M2，7.1cM)時，用M1選擇到純合抗病、雜合體、純合感病比例分別是26.3%、72.5%、1.2%，而用M2分別是81.8%、18.2%、0。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

據(jù)此提出相斥相顯性RAPD標記不論對顯性還是隱性基因均可極大提高選擇效率。由此可預見用相斥相的顯性SCAR標記跟蹤目標基因比相引相應更有效。

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6世代的影響

在早代(BC1)變異方差大，重組個體多，中選機率大，因此背景選擇時間應在育種早期世代進行，隨著世代的增加，背景選擇效率會逐漸下降。在早期世代，分子標記與QTL的連鎖非平衡性較大，隨著世代的增加，效應較大的QTL被固定下來，MAS效率隨之降低。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種7控制性狀基因(QTL)數(shù)目

模擬研究發(fā)現(xiàn)隨著QTL增加，MAS效率降低。當目標性狀由少數(shù)幾個基因(1-3)控制時，用標記選擇對發(fā)掘遺傳潛力非常有效，然而當目標性狀由多個基因控制時，由于需要選擇世代較多，加劇了標記與QTL位點重組，降低了標記選擇效果，在少數(shù)QTL可解釋大部分變異的情況下，MAS效率更高。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種8控制數(shù)量性狀QTL的劃分、定位及其效應分布

QTL的準確發(fā)現(xiàn)和對其效應無偏估計有助于MAS效率提高。QTL精確定位取決于分子連鎖圖譜的飽和度以及對QTL性狀的準確度量，可利用永久分離群體通過反復試驗精確定位QTL。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

互作大小直接影響著MAS效率。一般在不同年份間不同時期不同地點均能檢測到的QTL的效果較好。基因型對QTL檢測有較大影響，雜交早代植株基因型是雜合的。隨著自交代數(shù)增加，許多位點趨于純合，在早代選擇的植株到高代表現(xiàn)會與原先表現(xiàn)不一致，應重新估價和篩選分子標記。同一性狀在不同群體間甚至不同群體大小間的QTL不一致，這些因素均影響QTLs檢測并影響MAS的效率。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種9選擇強度和QTLs的遺傳方式和相位

在高選擇強度下，常規(guī)選擇更易丟失有利基因，MAS效率隨著選擇強度升高而增加。顯性作用隨著世代增加而降低，因此顯性遺傳QTLs的MAS效率高。當對多個QTL進行選擇時，相引連鎖比相斥連鎖MAS效率高。在中等或較低選擇強度下，目標基因(QTL)周圍染色體區(qū)段由較遠端標記控制更有效。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種第二節(jié)分子標記輔助選擇的策略

作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種一、作物MAS育種須具備的條件

分子標記與目標基因共分離或緊密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群體中利用分子標記進行篩選的有效手段，主要是應用PCR技術。篩選技術在不同實驗室間重復性好，且具有經(jīng)濟、易操作的特點。具有實用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計算機數(shù)據(jù)處理軟件。作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種二、MAS育種方法（一）回交育種（二）SLS-MAS（三）MAS聚合育種作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

受體親本×供體親本

(不含優(yōu)質基因)(含優(yōu)質基因)F1×受體親本BC1目標基因定位標記輔助選擇

中選BC1×受體親本

(含優(yōu)質基因)BC2BC3標記輔助選擇標記輔助選擇中選BC3(含優(yōu)質基因)

新育成的優(yōu)質品種(受體親本遺傳本背景+優(yōu)質基因)自交目標基因的定位與標記輔助回交育種相結合程序圖

中選BC1×受體親本

(含優(yōu)質基因)作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

受體親本×供體親本A(無優(yōu)質基因)(含優(yōu)質基因A)

受體親本×供體親本B(無優(yōu)質基因)(含優(yōu)質基因B)F1(含優(yōu)質基因A)×F1(含優(yōu)質基因B)復雜雜種(分離群體)

受體親本×供體親本C(無優(yōu)質基因)(含優(yōu)質基因C)

中選雜種個體×F1(含優(yōu)質基因A和B)(含優(yōu)質基因C)復雜雜種(分離群體)

中選雜種個體×受體親本(含優(yōu)質基因A、B和C)

新育成的優(yōu)質品種

(受體親本遺傳背景+優(yōu)質基因A、B和C)回交1~2代，標記輔助選擇自交標記輔助選擇標記輔助選擇標記輔助基因聚合與品質改良相結合程序圖作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種三、提高分子標記的篩選效率（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子標記進行育種選擇（三）克服連鎖累贅（四）降低MAS育種的成本作物育種學總論第十四章分子標記輔助選擇育種

MAS育種研究范圍：1.分子標記與資源評價（度量遺傳多樣性）2.分子標記與親本選配3.MAS增強作物抗病性（轉移新的抗性基因，抗性基因的累加或聚合）4.MAS提高作物雜種產量

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