病毒性肝炎的病原檢測課件

病毒性肝炎的病原檢測李剛中山大學附屬第三醫(yī)院感染病科

甲型肝炎⑴抗HAVIgM：病后數天即可陽性，3～6月轉陰。是早期診斷甲型肝炎最簡便而可靠的血清學標志。⑵抗HAVIgG：出現稍晚，于2～3個月達到高峰，持續(xù)多年或終身?？笻AVIgG陽性表示受過HAV感染。屬于保護性抗體，具有免疫力的標志。穗港人群不同年齡抗HAVIgG陽性率年齡廣州香港陽性數/檢測數（%）陽性數/檢測數（%）<1045/149（30.2%）

3/51（5.8%）

10~156/337（46.3%）

10/84（11.9%）

20~179/267（67.0%）

21/91（23.1%）

30~90/127（70.9%）

67/94（71.3%）

40~93/104（89.4%）

344/414（83.1%）合計

563/984（57.2%）

445/734（60.6%）

HBV基因及編碼蛋白乙型肝炎血清學標志物檢測技術發(fā)展史推出年代檢測方法檢測下線評論1960放射免疫分析法pg,fg孵育時間長，污染，不能全自動化1970酶免疫分析法ng結果不穩(wěn)定,線性區(qū)間較小1980熒光/化學發(fā)光/增強化學發(fā)光ng,pg1996電化學發(fā)光pg最新,最先進目前市場情況1大多采用酶免檢測方法

(1)1970酶免疫分析法ng水平

(2)突變HBsAg的不能檢出或檢出能力明顯降低（3）E抗原無法定量

(4)檢測周期長2化學發(fā)光檢測逐漸增加

收費標準已建立廣東:40元/T

乙型肝炎一、HBsAg與抗HBs

HBsAg在感染HBV兩周后即可陽性。只要HBsAg陽性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染。

抗HBs為保護性抗體，陽性表示對HBV有免疫力。低滴度應注意假陽性。乙型肝炎HBsAg與抗HBs

HBV感染后可出現HBsAg和抗HBs同時陰性，即所謂窗口期，此時HBsAg已消失，抗HBs仍未產生，少部分病例始終不產生抗HBs。

HBsAg和抗HBs同時陽性可出現在HBV感染恢復期，此時HBsAg未消失，抗HBs已產生；另一情形是S基因區(qū)發(fā)生變異，野生株抗HBs不能將其清除；或抗HBs陽性者感染了免疫逃避株。HBsAg定量稀釋度1:512

光密度S/CO

截止值COI

納克ng

HBsAg★化學發(fā)光:敏感性更高（0.03ng/mL），ELISA的10倍特異性更強檢測突變更出色精密度更高，小于5%；ELISA為20%

檢測線性范圍更廣，0.03～

400ng/mL

ELISA

0.2～

50ng/mLHBsAg★常用ELISA法檢測?！锬壳癏BsAg診斷試劑質量較高，靈敏度可達0.2ng/L。從全國室間質控評價結果顯示，陽性標本檢出率達到或超過98％?！?/p>

HBsAg滴度越高，HBeAg、HBVDNA陽性的可能性越大?！镅号c肝組織的HBsAg含量并不完全相關。為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染？★檢測試劑不夠敏感。

Abbott試劑盒由ad亞型抗體和抗原制備，對ay亞型的靈敏度較低?！?/p>

S基因變異（抗原性發(fā)生改變）?！?/p>

X基因變異（轉錄受抑制）?！镏丿BHCV感染（干擾HBsAg合成）。如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？★

提高檢測敏感性

—表面等離子共振生物傳感

—非競爭性毛細管電泳

—免疫傳感

—納米磁性微球★采用針對變異抗原的檢測試劑★

HBVDNA的檢測★

組織中標志物的檢測抗HBs?ELISA:半定量?電化學發(fā)光:2～

1000IU/L抗HBs陽性就萬無一失了嗎？?

低滴度應注意假陽性?單一抗HBs陽性HBVDNA檢出率0-11.8%：

★

先后感染了不同的HBV亞型

★

S基因變異

★

X基因變異

指示免疫應答Anti－HBS(IU/l)接種的要求 <10立即11-1003-6月后101－10001年后1001－1000031/2年后>10000 7年后HBsAg與抗HBs共存★可出現在HBV感染的恢復期，此時

HBsAg未消失，抗HBs已產生，大部分歸功于檢測敏感性的提高。★S基因發(fā)生變異，野生株抗HBs不能將其清除；★抗HBs陽性者感染了不同亞型HBV或免疫逃避株。基因變異導致HBsAg與抗HBs共存★

aa126蘇氨酸絲、異亮氨酸★

aa141賴氨酸谷氨酸★

aa145甘氨酸精氨酸★前S1nt3025-3154缺失乙型肝炎

HBeAg與抗HBe

HBeAg的存在表示病毒復制活躍且有較強的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產生稱為血清轉換?？笻Be陽轉后，病毒復制多處于靜止狀態(tài)，傳染性降低。但長期抗HBe陽性者并不代表病毒復制停止或無傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測到HBVDNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導致不能形成HBeAg。HBeAg定量

S/COCOIPEIU/mL(Paul-ErlichInstitute)HBeAg

★是重要的免疫耐受因子，大部分情況下其存在表示患者處于高感染低應答期。

★HBeAg與HBVDNA有良好的相關性。

★陽性標本HBVDNA檢出率90％左右。HBeAg水平與HBVDNA的關系★HBeAg0.28～134PEIU/L,HBVDNA5.58±1.84e

。

★HBeAg

＞134PEIU/L,HBVDNA6.93±1.03e。HBeAg陰性/抗HBe陽性，HBVDNA陽性HBV感染

★

HBVDNA水平一般較低?！?/p>

90%以上由于nt1896位突變引起。乙型肝炎

HBcAg與抗HBc

HBcAg陽性表示血清中存在Dane顆粒，

HBV處于復制狀態(tài)，有傳染性。常規(guī)不作為檢測項目抗HBc

IgM是HBV感染后較早出現的抗體，絕大多數出現在發(fā)病第一周，多數在6個月內消失。高滴度的抗HBc

IgM對診斷急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎急性發(fā)作有幫助。抗HBc

IgM

>100PEIU/mL

急性

<100PEIU/mL

慢性乙型肝炎抗HBc

抗HBc

IgG

絕大部分HBV感染者為陽性，因為HBcAg的抗原性很強。

單一抗HBc

IgG陽性者可以是過去感染，因其可長期存在；亦可以是低水平感染，特別是高滴度者?？笻Bc陰性的原因

★免疫耐受?！餀z測試劑原因，目前試劑準確性約85%。★C區(qū)突變。

HBVDNA檢測的臨床意義⒈診斷方面：

⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依據⑵HBVDNA是HBV復制的標志⑶HBVDNA是患者具有傳染性的標志HBVDNA檢測的臨床意義

⑷對HBV-M起補充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C區(qū)變異）

②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S區(qū)變異）③低水平感染單項抗HBc(﹢)乙型肝炎

HBVDNA檢測的臨床意義⒉療效判斷：

HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標

HBVDNA1IU=5copies100IU=500copiesHCVRNA1IU=2copies100IU=200copiesHBVDNA1IU=5.3copies(Amplicor)1IU=5.6copies(Versant)1IU=5.8copies(TaqMan)HBVDNA500copies=

95.1IU(Amplicor)=89.3IU(Versant)=86.2IU(TaqMan)

=5X10-4MEq=2.7Log10copiesHBVDNA1000copies=190IU(Amplicor)=179

IU(Versant)=172IU(TaqMan)

=1X10-3MEq=3.0Log10copies

HBVDNA檢測下限國產500～1000copies進口50～

200copiesHCVRNA檢測下限國產1000～2000copies進口100copiesHBVDNA檢測方法⒈雜交

⒉定性PCR（基本淘汰）

⒊定量PCR（主流）⒋基因芯片（將來？）HBVDNA檢測方法的比較

斑點雜交PCR定量PCR敏感性

105102102特異性高稍低高重復性好稍差好定量范圍

466簡便較繁瑣簡便簡便安全性好好好設備便宜稍貴昂貴技術要求低高高檢測價格低中高基因芯片

陽性參照熒光信號值大于35000，探針10位置處的熒光信號值為3378、3228，探針14位置處的熒光信號值為12643、11498，探針16位置處的熒光信號值為16278、16595，探針17位置處的熒光信號值為52009、53246，探針18位置處的熒光信號值為3876、4550，陰性對照熒光信號值均小于400，空白對照處熒光信號值小于50。此反應區(qū)的結果判讀為HBVDNA(+)、HCVRNA(+)、YVDD變異和HCV1b＋3b型。芯片掃描結果芯片信號強度和HBVDNA定量檢測結果的比較血清編號芯片信號平均值定量檢測結果81039851018518686618865608679981212810018076581668818238306683072830768475285149825538242682938829391811024069174861777121725230221461111759164371615415195131731607312899104301348287958369878183691.01×1092.97×1091.08×1091.35×1091.42×1091.73×1093.82×1071.68×1075.96×1073.28×1073.24×1072.97×1074.38×1071.90×1072.30×1073.19×1075.07×1052.46×1056.24×1053.79×105

基因芯片與HBVDNA定量檢測HBV結果比較基因芯片陽性陰性

陽性194HBVDNA定量陰性215

符合率為85%(34/40)，芯片檢出率為82.61%(19/23),假陽性率為11.76%(2/17).

芯片檢測HBVYMDD變異株與測序法檢測結果的比較標本編號基因芯片法DNA測序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未檢出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDDYVDD

基因芯片與錯配PCR檢測YMDD變異株結果比較基因芯片陰性YMDDYVDDYIDD混合

錯陰性

30000配YMDD1

3

11

2PCRYVDD12

5

00YIDD00001

混合00000

5份芯片檢測的標本與DNA序列測定結果一致

我科1474例HBV-M與HBVDNA結果分析

HBsAg

HBeAg

HBcAb

HBsAb

HBeAb

例數HBVDNA(+)

例數(%)1+++--603520（86.2）2+-+-+465163（35.1）3++---1918（94.2）4+-+--21688（40.7）5+---+53（60）6--+++201（5）7--++-271（3.7）8--+-+242（8.0）9---++10（0）10---+-562（3.6）11--+--263（11.5）12++++-22（100）13-----100（0）合計1474803

注：數據引自陳雪娟論文乙型肝炎

組織中HBV標志物的檢測可用免疫組織化學方法檢測肝組織中HBsAg、HBcAg的存在及分布；原位雜交或原位PCR方法檢測組織中HBVDNA的存在及分布。除可判定病毒是否處于復制狀態(tài)外，對血清中HBV標志物陰性病人的診斷有一定意義。

HBV基因型的檢測

PCR(SNP,RFLP

)

序列測定

基因芯片耐藥的位置和檢測LVD:M204I/VADV:N236T和/或A181VETV：(1)M250V或I169T或S202I/G或T184G/A/I/S(2)M204VI+(1)L-dT:M204I/V拉米夫定恩替卡韋替比夫定阿德福韋V173LL180MA181VA184GS202IM204IM204VN236TM250VYangetal

Hepatology2003;38:705ALaietal

Hepatology2003;38:262AColonno

etal43rdICAAC;Abst#V-786LeungetalHepatology2001;34:349A耐藥變異株檢測方法核苷酸序列測定法(PCR產物直接測序)(準種池20%)聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)5%實時PCR(real-timePCR)10%聚合酶鏈反應微板核酸雜交-酶聯免疫黏附法(PCR-ELISA)基因芯片技術(microarray)反向雜交法(INNO-LiPA)5%-10%基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOFMS)1%

芯片檢測HBVYMDD變異株與測序法檢測結果的比較標本編號基因芯片法DNA測序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未檢出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDDYVDD

基因芯片與錯配PCR檢測YMDD變異株結果比較基因芯片陰性YMDDYVDDYIDD混合

錯陰性

30000配YMDD1

3

11

2PCRYVDD12

5

00YIDD00001

混合00000

5份芯片檢測的標本與DNA序列測定結果一致

丙型肝炎

抗HCVIgM和抗HCVIgG：HCV抗體不是保護性抗體，是存在HCV感染的標志?？笻CVIgM在發(fā)病后即可檢測到，一般持續(xù)1～3個月。如果抗HCVIgM持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復制，易轉為慢性。低滴度抗HCVIgG提示病毒處于靜止狀態(tài)，高滴度提示病毒復制活躍?？笻CV-IgG

ELISA（第三代）

顆粒吸附（雅培）蛋白印跡蛋白芯片蛋白芯片含抗C、抗NS3、抗NS4、

抗NS5片段124例HCV感染者ELISA和蛋白芯片檢測結果

蛋白芯片

陽性陰性合計

陽性1131114ELISA

陰性2810合計1159124注：數據引自舒欣博士論文124例HCV感染者PCR和蛋白芯片檢測結果

蛋白芯片

陽性陰性合計

陽性75176HCVRNA定量

陰性40848合計1159124注：數據引自舒欣博士論文抗HCV-IgM較易出現假陽性。

目前國內的試劑盒均未經過批準注冊。丙型肝炎

HCV抗原檢測

HCV核心抗原檢測試劑盒：特異性高：100%

敏感性差：45.68%(37/81)注：數據引自曹紅碩士論文HCVcAg與抗HCVIgG檢測結果比較*這2例血清的HCVRNA定量檢測分別為：2.4×105、5.2×106（copies/ml），回顧臨床資料顯示，這2例靜脈吸毒者靜脈吸毒時間分別為3月和2月。

HCVcAg與HCVRNA檢測的結果比較

HCV-RNA合計

+-HCVcAg

+37037

-313656合計

682593注：數據引自曹紅碩士論文丙型肝炎HCVRNAHCVRNA陽性是病毒感染和復制的直接標志。HCVRNA亦可定量，定量測定有助于了解病毒復制程度、抗病毒治療的選擇及療效評估等。丙型肝炎為什么要同時檢測抗HCV及HCVRNA？

★抗病毒治療的要求。

★防止漏診。本科調查93例靜脈吸毒者中，抗HCV和HCVRNA同時陽性66例，抗HCV陽性79例，HCVRNA陽性68例。

單純抗HCV陽性13例，單純HCVRNA陽性2例。表明：單做其中一項可能導致漏診。93例靜脈吸毒者抗HCV和HCVRNA檢測結果

HCVRNA

陽性陰性合計

陽性661379抗HCVIgG

陰性21214合計682593注：數據引自曹紅碩士論文基因芯片

芯片信號強度與HCVRNA定量檢測結果的比較血清編號芯片信號平均值定量檢測結果84733764808209579941774528978677452847339271385276699717630566572704126883377712791957980271545928304962749158475306149860512526286244449052500786534773004263343670466834205339761474594570737222413251.36×1061.42×1061.02×1062.88×1062.18×1062.12×1