時間分辨乙肝應(yīng)用課件

時間分辨乙肝應(yīng)用1放射免疫分析技術(shù)radioimmunoassay

RIA同位素高度靈敏＋免疫反應(yīng)特異性靈敏度高:達到ng甚至pg水平特異性強重復(fù)性高

標本用量少極大地推動了臨床和科研進步標記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。2缺點3125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標記物125I的穩(wěn)定性差,導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大;標準曲線有效期短,必須每次定標,造成浪費。操作繁瑣,出報告時間長。無法保存?zhèn)溆谩７派湫?125I),對環(huán)境的污染及對身體的危害,差不多為重視環(huán)保的國家逐步取消。(如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室)酶免疫分析法enzyne

immunoassay

EIA酶的高效催化＋免疫反應(yīng)特異性幸免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。操作簡單,不需要特別設(shè)備,容易推廣。

曾經(jīng)一度被認為是取代放免的檢測手段。4缺點5對底物的顯色遵循比爾定律,標準曲線的直

線范圍窄靈敏度、重復(fù)性不及放免,易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響,導(dǎo)致穩(wěn)定性不行?；瘜W發(fā)光免疫分析法(CLIA)chemiluminescen

immunoassay光反應(yīng)的高度靈敏＋免疫反應(yīng)特異單個樣本檢測速度快,適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。6缺

點7發(fā)光過程短,樣品不能重復(fù)檢測。本底較高,易受環(huán)境物質(zhì)干擾。試劑穩(wěn)定性較差,需多次定標。檢測精度不高,在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑;試劑價格高。電化學發(fā)光免疫分析(ECL)electrochemiluminescence電化學＋免疫反應(yīng)80年代末期問世的新型化學發(fā)光免疫分析方法。8電化學發(fā)光底物-三聯(lián)吡啶釕

N羥基琥珀酰胺(NHS)酯9電極表面的電化學發(fā)光反應(yīng)10本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。能夠作急診非開放性試劑系統(tǒng)。試劑價格過高。11免疫熒光測定技術(shù)(IFA)Immunofluorescence

assay12熒光物質(zhì)＋免疫反應(yīng)細胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高本底高時間分辨熒光免疫分析技(TRFIA)Time-Resoled

Fluoroimmunoassay鑭系元素標記技術(shù)＋免疫反應(yīng)13一、基本原理固相Ab受檢抗原Eu標記抗體14Excitation15ExcitationExcitationExcitationExcitiatatitoionnExcitiatatitoionn二、TRFIA的主要特點16(一)靈敏度高、特異性強酶聯(lián)免疫(精度:10-9mol/L)放射免疫(精度:10-12mol/L)化學發(fā)光(精度:10-15mol/L)電化學發(fā)光(精度:10-17mol/L)時間分辨熒光(精度:10-18mol/L)生物芯片17試劑DELFIAImmuliteACS-180AFP0、1-1000IU/ml0、2-300IU/ml1、0-1000IU/mCEA0、1-500ng/ml0、2-500ng/ml0、5-100ng/mlHCG0、5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/LTSH0、005-100μU/ml0、002-75μU/ml0、03-150μU/mlFSH0、05-256mU/ml0、1-170mU/m0、3-200mU/ml18Prog 0、08-120nmol/LProlactin

0、04-250ng/ml無0、5-150ng/ml0、1-40ng/ml0、3-200ng/ml以上數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書標記物具有獨特熒光特性的稀土金屬---鑭系元素鑭系元素:15種Eu、Tb、

Sm、

Nd、

DyEu螯合物激發(fā)光19Eu螯合物熒光的特點高強度熒光

長壽命Eu螯合物714000ns20200800400

600熒光強度激發(fā)短壽命熒光白蛋白4.1ns球蛋白3.0nsFITC

4.5ns測量時間新循環(huán)1

Eu螯合物的熒光衰變時間特別長,極大地降低了檢測背景。1000次循環(huán)/s2

stokes位移大,激發(fā)光譜與發(fā)射光譜無重疊,特別容易排除散射光對發(fā)射光譜的影響、stokes位移:最大激發(fā)波長至最大發(fā)射波長之間的距離21激發(fā)光發(fā)射光Eu螯合物熒光光譜300

400

500

600波長nm熒光強度273nm異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300400

500

600波長nm熒光強度發(fā)射光激發(fā)光2250nmEu螯合物熒光光譜300

400

500

600波長nm熒光強度異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300

400

500

600波長nm熒光強度3

激發(fā)光譜帶較寬、可增加激發(fā)能,提高靈敏度234

發(fā)射光譜特別窄,50%的發(fā)射光譜寬度∠10nm,利用615±5范圍的濾光片,只允許此波段內(nèi)發(fā)射光通過并被檢測,排除其它波長的熒光,一方面降低了背景,另一方面使能量消耗減少,提高提高檢測靈敏度。異硫氰酸熒光素發(fā)射光譜300

400

500

600波長nm熒光強度Eu螯合物熒光光譜300

400

500

600波長nm24熒光強度5

Eu螯合物有相對高的比活性比活性:單位時間內(nèi),每個標記分子的可探測事件的數(shù)目熒光物質(zhì)相對比活性特別高 原因:在測定時,熒光物質(zhì)可反復(fù)被激活?；鶓B(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)光躍遷25發(fā)射熒光常用標記物的相對比活性26125I標記物1個可探測事件/s/7、5*106分子1個可探測事件/s/標記分子特別多個可探測事件/s/標記分化學發(fā)光標記物熒光標記物子(二)線性范圍寬27,28標準曲線穩(wěn)定試劑保質(zhì)期長0.5

1251020

50

100

200

500U/L51002000Cps.10

3DELFIA

hFSHN=6時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩(wěn)定,同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標(三)重復(fù)性好29TRFIA檢測HBsAg的重復(fù)性同一標本連續(xù)20次檢測,CV值∠2％。同一批(10個)標本連續(xù)3天檢測,其CV值=2、9%。檢測后反應(yīng)板連續(xù)3天重復(fù)閱讀,CV∠1％60030300700-

501000100200時間延遲(微秒)強度500發(fā)射光波長(納米)利用不同波長和不同時間檢測,在同一孔中可測量多個鑭系元素的量(四)同一標本孔同時檢測多個項目技術(shù)特點檢驗先進性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零本底、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復(fù)性更好原子標記標記位點多,可達20個對標記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性,高精確度試劑保質(zhì)期至少一年

標準曲線保留時間長

同一批次只需兩點定標多標記單,雙,三,四標記同一試劑盒可同時測多個項目

31三、應(yīng)用32內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列:

TSH,Ultra

TSH,T3,T4,

FT3,FT4,TBG,TG糖尿病系列:

Insulin,

C-Peptie生長激素類:

hGHCortisol其他:婦產(chǎn)科檢查FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBGPSA33hTG,腫瘤科檢查AFP

CEAβ-2

MicroNSEPAPPSA

EQMCA-199PSA(Free/Total)CA-50

CA-125CA-153*

CA-724*CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查:

hAFP/

βHCG

,PAPPA新生兒篩查:Neo-TSH,Neo-T4,Neo-IRT,34

Neo-17a-OH

Prog,PKU核酸探針及基因雜交檢測,多標記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝,乙肝,丙肝血液科檢測Ferritin,Vit貧血檢查:B12,Folic

acid白血病:免疫細胞分型等細胞學檢查細胞毒試驗等多種檢測項目,細胞質(zhì)及組織化學分析等多種檢測項目酶類檢測及細胞受體檢測(包括MHC,HLA等多種檢測)科研工具單標記檢測,雙標記檢測,三標記檢測,四標記檢測35時間分辨熒光免疫測定技術(shù)36在病毒性肝炎診斷和療效監(jiān)測中的應(yīng)用病毒性肝炎的種類Hepatitis

A

VirusHepatitis

B

VirusHepatitis

C

VirusHepatitis

D

VirusHepatitis

E

VirusHepatitis

G

VirusTTV37Hepatitis

Gvirus

(HGV)38Science、1996

Jan

26;271(5248):505-8、An

RNA

virus,

hepatitis

G

virus

(HGV),from

the

plasma

of

a

patient

with

chronichepatitis、entire

genome

(9392

nucleotides)encoding

a

polyprotein

of

2873aminoacids、HGV

was

associated

with

acute

andchronic

hepatitis、The

virus

is

transfusion-transmissible、It

has

a

global

distributionpresent

within

the

volunteer

blooddonor

population、39964099000102039798HGVand

GBV-C

were

two

isolates

of

thesame

virus、The

HGV/GBV-C

genomesequence

and

organization

are

closely41r

e

l

a

t

e

d t

o h

e

p

a

t

i

t

i

s

C v

i

r

u

s、infection

is

mon

and

frequently

persists

inhumans,infection

has

not

been

found

to

beassociated

with

any

known

disease

state、(acute

or

chronic

hepatitis)grow

in

lymphocytes

,

not

inhepatocytes,42Recent

studies

suggest

:43GBV-C

infection

in

HIV-positive

people

isassociated

with

prolonged

survival、coinfection

of

human

lymphocytes

withGBV-Cand

HIV

lead

to

decreased

HIV

replication、HGV

may

provide

novel

approaches

for

treatingHIV

and

AIDS、TT

virus

(TTV)found

in

1997

from

a

hepatitis

patientwithout

virus

markers、However,the

realimpact

of

TTV

on

liver

diseases

remainsuncertain

to

date、Due

to

the

lack

ofsuitable

cell

systems

to

support

the

growthof

TTV,the

biology

of

TTV

is

still

obscure、44HBsAgHBcAgHBV

DNAPolymerase45一、HBV的主要生物學性狀HBV感染 病毒在體內(nèi)大量復(fù)制病毒核酸進入血液分子生物學方法核酸定性或定量免疫反應(yīng)釋放病毒蛋白(Ag)刺激機體產(chǎn)生抗體血清學方法病毒抗原或抗體臨床診斷和療效觀察二、HBV感染診斷的主要實驗室指標46血清免疫學檢測的臨床意義HBV感染診斷的主要指標判斷機體對HBV的免疫狀況主要指標判斷病程的主要指標47Acute

Hepatitis

BDNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潛伏期潛伏 急性后期 早期急性期康復(fù)期痊愈標志物相對濃度有

傳

染

性可能有傳染

性有免力血清學轉(zhuǎn)換期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBc

IgMAnti-HBeAnti-HBs4疫8Chronic

HBV

Infection潛伏期(4-12周)急性感染(6個月)慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBc

IgMHBeAgAnti-HBeDNA493

HBV血清學標志物與HBV

DNA的關(guān)系血清學標志物:50反映機體對病毒的免疫狀況,病程,判斷病情。不能完全反映病毒在體內(nèi)復(fù)制狀況。HBVDNA反映病毒在體內(nèi)復(fù)制水平,觀察藥物療效,部分“

小三陽”及低水平病毒復(fù)制時出現(xiàn)陰性。不能反映機體的免疫狀況和病情三、

時間分辨熒光檢測

HBsAg與其它方法的比較51TRFIA與Elecsys

Systems

2010檢測

HBsAg定性結(jié)果比較52TRFIAElecsys

Systems

2010陽性陰性合計陽性60060陰性04040總數(shù)6040100靈敏度＝〔40／(0＋40)〕×100％＝100％53靈敏性＝〔60／(0＋60)〕×100％＝100％兩者符合率

100％與

EIA

檢測

HBsAg定性結(jié)果比較54TRFIAEIA陽性陰性合計陽性59160陰性04040總數(shù)5941100與Elecsys

Systems

2010檢測

HBsAg定量結(jié)果比較Elecsys

Systems

2010

檢測

HBsAg(COI)與TRFIA檢測HBsAg(ng/L)的相關(guān)性＝0、98755TRFIA在乙肝“兩對半”定量檢測應(yīng)用56一、 極大地提高了檢測的靈敏度TRFIA檢測HbsAg靈敏度可達0、2ng/ml,而酶標(ELISA)檢測HbsAg靈敏度是2ng/ml,也就是說只有血清中的HbsAg達到2ng/ml酶標才會呈陽性。1、縮短急性乙肝HBsAg

檢測“窗口期”572、如病毒發(fā)生變異后,表達量較低,常規(guī)

ELISA測不出抗原,而TRFIA定量具有極高的靈敏度,可發(fā)現(xiàn)并極有估計同時檢測出HbsAg和抗-Hbs。3

可發(fā)現(xiàn)低濃度HbsAg攜帶者。特別是一些群體如醫(yī)護工作者、病人家屬等,由于長期緊密接觸,但又非直截了當經(jīng)血傳播感染成急性乙肝,而是長期少量感染,并刺激機體產(chǎn)生一定的免疫力,估計呈低濃度感染,特別應(yīng)當引起人們的足夠重視,緊密關(guān)注并采取措施防止發(fā)展成乙肝或慢性攜帶者。58二、

動態(tài)觀察療效和病情監(jiān)測。59疾病的發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后是一個動態(tài)的變化的過程,TRFIA定量檢測乙肝“兩對半”各項標志物的濃度變化可對乙肝的病程、治療、預(yù)后起一個全程動態(tài)檢測的作用,能夠為醫(yī)生對病情療效作出合理的解釋提供依據(jù),指導(dǎo)治療。1、定量分析HbsAg和抗-Hbs的濃度變化,能夠預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。如HbsAg濃度降低,抗-Hbs的濃度逐漸升高,可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展。反之,HbsAg濃度處于較高水平或上升趨勢,而抗-Hbs一直處于較底水平,則容易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。602、定量分析HbeAg和抗-Hbe的濃度變化,能夠反映病情變化和治療效果。明確檢測HbeAg向抗-Hbe轉(zhuǎn)換的時期,即表現(xiàn)為HbeAg濃度下降和抗-Hbe濃度升高的過程。高濃度的HbeAg還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài),具有較高的傳染性。高濃度的抗-Hbe一方面提示病情的好轉(zhuǎn),而在某些時候(如肝功能指標特別差)估計與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。613、抗-Hbc濃度的高低能夠反映病毒感染的狀態(tài)。乙肝急性感染常常呈現(xiàn)高濃度的抗-Hbc,恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續(xù)高濃度。低濃度的抗-Hbc一般為恢復(fù)期或既往感染。624有利于對慢性肝炎活動性和非活動性的判斷。非活動性慢性乙肝各項指標相對穩(wěn)定,活動性往往呈進行性變化。63三、 血清HBV-DNA熒光定量PCR測定能