植物組織基因組DNA的提取與分析

1實驗六植物組織中DNA的提取與分析溫馨提示：1、請將教室水浴鍋翻開，溫度調(diào)至65℃。2、實驗中-20℃冰浴時，請將樣品放入6309室冰箱冷凍層。1精選ppt2〔1〕掌握植物組織中DNA提取的原理和方法?！?〕掌握DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法一、實驗?zāi)康?精選ppt二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需參加抗氧化劑或強復(fù)原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。CTAB,SDS等離子型外表活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。3精選ppt二、實驗原理再參加苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大局部蛋白質(zhì)。上清液中參加異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可參加RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。4精選pptCTAB法流程圖：植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA溶液5精選ppt6三、儀器和試劑1、儀器：恒溫水浴鍋、高速離心機、水平電泳槽、電泳儀。2、試劑：液氮、CTAB提取緩沖液、氯仿:異戊醇〔24:1〕、異丙醇、70%乙醇、TE緩沖液、上樣緩沖液〔0.5%溴酚藍+40%蔗糖〕、1×TAE電泳緩沖液。6精選ppt四、實驗步驟稱取0.1g植物幼苗加入適量液氮充分研磨，全部轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中加入0.5mlCTAB提取緩沖液，充分混合均勻65℃水浴10min，其間緩慢顛倒3次加入0.5ml氯仿:異戊醇，上下顛倒充分混勻12000r/min離心10min將上層水相移入另一新離心管加0.5ml預(yù)冷異丙醇，-20℃冰浴30min12000r/min離心10min棄上清，沉淀用0.5ml70%乙醇懸浮棄上清，加20μLTE溶解沉淀，即得DNA溶液12000r/min離心10min1、DNA的提取7精選ppt8四、實驗步驟2、DNA電泳檢測〔1〕1%瓊脂糖凝膠：稱取0.3g瓊脂糖，參加30mL1×TAE緩沖液，在微波爐中加熱，反復(fù)加熱、振蕩2-3次，使瓊脂糖充分融化。待凝膠冷卻至60℃左右，倒入插入梳子的凝膠板中〔防止產(chǎn)生氣泡〕，讓凝膠自然凝固。〔2〕待凝膠凝固后，小心拔出梳子，防止前后左右搖晃，以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠和膠床放入電泳槽中，加樣孔靠近陰極的一端。8精選ppt9四、實驗步驟2、DNA電泳檢測〔3〕上樣電泳：將20μLDNA樣品溶液和5μL上樣緩沖液混勻后，上樣，100V穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠?！?〕照膠、拍照：將凝膠泡在EB溶液〔注意：EB溶液為劇毒物，需帶上一次性手套拿取凝膠〕中10min左右，進入暗室，使用凝膠成像系統(tǒng)照膠并拍照。9精選ppt10五、實驗結(jié)果與分析

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4圖1植物組織基因組DNA提取結(jié)果將凝膠圖片打印出來，需要說明：1、小組點樣孔號；2、DNA質(zhì)量分析。10精選ppt六、本卷須知〔1〕葉片磨得越細越好?！?〕移液器的使用?！?〕由于植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中參加EDTA抑制酶的活性外，第一步〔研磨〕的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。11精選ppt121、在DNA抽提