生物技術(shù)專業(yè)畢業(yè)論文報告

青島海域爆發(fā)滸苔的光合作用研究及分子鑒定

PhotosynthesisandmolecularidentificationoftheoutbreakoftheQingdaowatersEnteromorpha08生技三班趙許峰滸苔的根本性狀滸苔Enteromorphaprolifera屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、滸苔屬,是一種常見大型海洋綠藻,藻體管狀,膜質(zhì),細胞單層,主枝明顯,分枝細長.幼體時期通過假根附著于固體基質(zhì)生長,廣泛地分布于潮間帶區(qū)砂礫、巖石、泥灘上,成體藻體和斷裂的成體藻體碎片可漂浮生長。青島海域爆發(fā)滸苔的起源2023年黃海衛(wèi)星照片顯示證明綠潮起源于離青島海域180km的江蘇省海岸線。其主要原因是可能歸結(jié)于江蘇省沿岸的紫菜擴大養(yǎng)殖。之前有研究說明滸苔是紫菜養(yǎng)殖架上的主要污染海洋藻類，因此，在江蘇省沿岸的22974公頃的紫菜養(yǎng)殖海域中，紫菜養(yǎng)殖架為滸苔的生物量累計提供了“溫床〞。研究目的研究黃海滸苔爆發(fā)地區(qū)滸苔的光和作用，并對青島地區(qū)爆發(fā)滸苔進行分子生物學(xué)鑒定。材料來源本實驗所應(yīng)用的滸苔均采自青島海域以及由國家海洋局第一研究所實驗中心提供。實驗試劑蔗糖，可溶性淀粉，瓊脂糖，裂解緩沖液，變性緩沖液，異丙醇，70%的乙醇，去離子水，硫酸亞鐵，酒石酸鉀鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，氯化亞錫，苯酚，硫酸，無水乙醇，葡萄糖，0.45um微孔濾膜，甲酰胺，甲醇，冰醋酸。主要儀器722S型分光光度計，ZD2型自動電位滴定儀，SHAC型水浴恒溫振蕩器，YXQS46280型高壓蒸汽滅菌器，GZX9146MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱，高速離心機，顯微鏡，電子顯微鏡，U-3310紫外分光光度計，Niskin采水器，CTD，0．45uM濾膜，高效液相色譜儀1.滸苔的分子鑒定采樣站位與時間2023年7月9日至16目，研究人員跟隨“北斗〞號科學(xué)考察船對衛(wèi)星照片顯示具有大面積綠潮藻類出現(xiàn)的黃海海域(北緯33.5度至北緯36度，東經(jīng)120度至東經(jīng)122度)進行調(diào)察，共采集到這一海域中22個站位的滸苔樣品，其中包括20個站位的飄浮滸苔以及2個站位(J13及J20-1)的拖網(wǎng)樣品。青島的漂浮滸苔樣品采自棧橋潮問帶滸苔的分子鑒定將滸苔用無菌水清洗3遍，用吸水紙吸干，利用天根植物全基因組提取試劑盒〔DP320〕提取全基因組DNA。設(shè)計IST擴增引物設(shè)計分別為T1〔5，-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，〕與T2〔5，-TTCCTTTTGCTTATTGATATGC-3，〕，PCR反響體系為25uL，其中包括：10×PCRbuffer2.5uL，2.0mmol/LMgCl22.0uL，10mmol/LdNTPs0.5uL，10umol/L引物T1和T2各1uL，TaqDNA聚合酶〔Promega〕0.2uL，DNA模板1uL。反響條件為94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃繼續(xù)延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收純化之后，送北京六合華大基因科技持股測序。用于序列分析以及系統(tǒng)進化分析的滸苔及石莼的ITS及5.8SrDNA序列從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。用ClustalW軟件進行多序列比對記憶序列相似性分析。用Phylip3.65軟件中最大簡約法〔Maximumlikelihood〕和Mega4.0軟件中的鄰接法〔Neighbor-Joining〕構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1000次計算Bootstrap值。2.青島海域漂浮和沉降滸苔的光合作用研究滸苔葉狀體由專人乘中國科學(xué)院海洋研究所“創(chuàng)新號〞考察船于綠潮爆發(fā)期間在海況允許的情況下間斷出海采集。本文選擇經(jīng)比較檢測說明目前光合活性最高的2023年7月12日采集的青島奧帆基地A賽區(qū)南側(cè)海域(北緯36度,東經(jīng)120度24分)水表藻體以及采自團島灣(北緯36度20分，東經(jīng)120度17分)泥表(圖5)藻體,作為水表漂浮藻體和泥底沉降藻體的代表。用毛筆輕輕洗凈藻體外表污泥和附生雜藻,并經(jīng)顯微鏡鏡檢確認藻體無雜藻污染后待用。實驗材料2.1葉綠素光譜特性及含量的測定取新鮮滸苔藻體，用濾紙輕輕吸干藻體外表水分，稱取0.5g藻體放入研缽中液氮研磨。藻體磨碎后加少許石英砂和5mL丙酮繼續(xù)研磨成勻漿狀，參加5mL80%丙酮抽提。10000×g室溫離心10min，棄沉淀，80%丙酮定容上清20mL。以80%丙酮作為空白對照，對樣品進行350-800nm的波長掃描，讀取663nm和645nm處的光密度值。重復(fù)3次以上，計算平均值

2.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定利用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)用IMAGING-PAMMicroscopy調(diào)制脈沖熒光儀通過葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線和光響應(yīng)曲線測定了不同來源的滸苔葉狀體葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)。樣品暗適應(yīng)15min以弱調(diào)制測量光測定初始熒光；以強飽和脈沖激發(fā)后測量最大熒光，重復(fù)5次。樣品的快速光響應(yīng),同樣通過IMAGING-PAMMicroscopy調(diào)制脈沖熒光儀測定。將經(jīng)過光適應(yīng)5min的樣品，暴露在連續(xù)光強梯度(PAR3,26,46,65,102,146,195,259,337,418和497umolm-2s-1下，每步20s，測定相對電子傳遞速率ETR。2.3光合放氧速率測定樣品預(yù)處理：取0.06g新鮮(FW)樣品于20℃循環(huán)水浴中溫浴15min。氧電極Oxygraph(Hansatech)測定其光合放氧速率，反響介質(zhì)為20℃消毒海水，光照強度選擇預(yù)實驗測定的滸苔葉狀體飽和光強600umolm-2s-1光合速率表示為每單位鮮重藻體的放氧速率以凈光合放氧速率與呼吸耗氧速率之比獲得P/R的值。2.4呼吸耗氧速率測定樣品預(yù)處理：取0.06g新鮮樣品于20℃恒溫水浴中溫浴15min,暗適應(yīng)20Min。呼吸耗氧速率通過氧電極Oxygraph測定，反響介質(zhì)為20℃消毒海水。呼吸速率表示為每單位鮮重藻體的耗氧速率。3.結(jié)果與討論3.1分子鑒定結(jié)果取自23個不同站位滸苔樣品的ITS序列以及5.8SrDNA序列的PCR片段總長度為540bp，其中ITS1長度為189bp，5.8SrDNA全序列長度為160bp，ITS2長度為181bp。從序列比對的結(jié)果內(nèi)差異〔圖6〕。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的石莼屬以及滸苔屬的ITS以及5.8SrDNA的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與來自日本的一種滸苔屬滸苔〔Enteromorphaprolifera〕的ITS以及5.8SrDNA序列的相似性最高，僅在第5個堿基處缺失一個堿基A。系統(tǒng)進化樹

為構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了l4個滸苔屬及4個石莼屬的ITS和5.8SrDNA的全序列，并以狹帶藻的ITS和5．8SrDNA全序列作為外群。采用Mega4.0中的鄰接(NJ)法及Phylip3.65軟件中的最大簡約法構(gòu)建了ITS及5.8SrDNA的系統(tǒng)進化樹，兩棵進化樹具有類似的拓撲結(jié)構(gòu)，僅有Ulvapertusa的分枝不同，說明了系統(tǒng)進化樹的可靠性。文中給出的是NJ法構(gòu)建的ITS序列的系統(tǒng)樹，從該系統(tǒng)進化樹可以看出，本次綠潮滸苔與滸苔屬滸苔(Enteromorphaprolifera)聚類在一起。基于NJ法構(gòu)建的ITS序列的系統(tǒng)進化樹3.2滸苔的光合作用研究結(jié)果

右圖為滸苔樣品提取色素的吸收光譜，葉綠素a的最大吸收波長在436和663nm,葉綠素b的最大吸收波長為463和645nm。如圖8所示，奧帆A賽區(qū)南部水表(a)和團島灣泥表(b)滸苔提取的色素樣品具有相似的波形。由此可見，奧帆A賽區(qū)南部表層和團島灣泥表滸苔具有相近的色素組成與比例。然而在色素含量方面卻截然不同：奧帆A賽區(qū)南部水表漂浮滸苔的色素含量明顯高于團島灣泥表沉降滸苔。經(jīng)計算,水表藻體葉綠素a和葉綠素b含量都明顯比泥表藻體高,然而葉綠素a與葉綠素b的含量比卻非常接近1.色素吸收光譜2.葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)

從滸苔藻體的光響應(yīng)曲線(圖9)可以看出,奧帆A賽區(qū)南部表層藻體的光響應(yīng)曲線培養(yǎng)前后保持了比較穩(wěn)定的狀態(tài),除了光飽和點和ETR值培養(yǎng)前和培養(yǎng)后相比略有下降外,在培養(yǎng)前和培養(yǎng)后保持了比較穩(wěn)定的水平；而由圖9(a)可見團島灣泥表藻體的光響應(yīng)在培養(yǎng)前就表現(xiàn)得比較微弱,在培養(yǎng)后那么完全失去了光響應(yīng)(圖9(b))。從圖10(a)可以看出,奧帆A賽區(qū)南部水表藻體的參數(shù)值Fv/Fm約為0.6，比團島灣泥表的藻體高出了7倍多,奧帆A賽區(qū)南部水表藻體的參數(shù)Y(Ⅱ)更是比團島灣泥表的藻體高出了15倍有余。而從參數(shù)Y(NPQ)和Y(NO)的值來看,團島灣泥表的藻體都比奧帆A賽區(qū)南部水表藻體高出了1倍。培養(yǎng)24h后可以看出,對于奧帆A賽區(qū)南部水表的藻體來說,參數(shù)Fv/Fm出現(xiàn)了明顯的下降,從0.6左右下降到了0.5左右；參數(shù)Y(Ⅱ)稍有下降,而參數(shù)Y(NPQ)和Y(NO)都略有上升。對于團島灣泥表的藻體,在培養(yǎng)24h后參數(shù)Fv/Fm,Y(Ⅱ)和Y(NPQ)降至0；與此同時Y(NO)上升到1(圖10(b))。3.光和放氧和呼吸從圖11(a)和11(c)來看，A賽區(qū)南部水表滸苔藻體的放氧速率、呼吸速率和P/R都顯著高于團島灣泥表藻體，其中放氧速率高出約達26.6倍，呼吸高出約3.5倍，P/R高出約5倍；從圖11的比較中可以看出,在培養(yǎng)24h后團島灣泥表藻體的放氧速率和P/R表現(xiàn)為負值，呼吸速率明顯升高；而A賽區(qū)南部水表滸苔藻體的放氧速率和P/R僅稍有降低，呼吸速率有略微升高。4結(jié)果分析4.1分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

目前對于藻種的鑒定已經(jīng)越來越多的借助于分子生物學(xué)的方法。真核生物核糖體編碼基因中18SrDNA，5.8SrDNA和28SrDNA組成一個轉(zhuǎn)錄單位，彼此被轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)ITS分開。ITS不屬于編碼區(qū)域，進化速率比編碼區(qū)域快，即使是親緣關(guān)系十分接近的物種，在該區(qū)域也存在核酸差異，而且隨親緣關(guān)系的疏遠差異會迅速擴大。近年來，ITS序列在綠潮藻類及石莼屬藻種鑒定方面起了重要作用。本次黃海綠潮，從不同站位采到的滸苔樣品，形態(tài)觀察差異較大，不管是藻體的顏色、主枝的形態(tài)和厚度、以及絲狀體的形態(tài)和細胞的大小等均有明顯差異，難以確定是否屬于同一種滸苔。通過分子生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)所有這些滸苔樣品都具有完全一樣的ITS序列，從而確定造本錢次黃海滸苔綠潮的滸苔均同為一個種，聚類分析說明是滸苔屬滸苔(Enteromorphaprolifera)4.2滸苔的光合作用研究結(jié)果分析這些結(jié)果說明,雖然漂浮藻體光合活性較強,但潛在光合活性明顯低于正常值,而泥表藻體的光合活性極弱,提示截至2023年7月中旬該海域的漂浮滸苔藻體已受到了較嚴重的環(huán)境脅迫,說明青島海域自然環(huán)境已不適于滸苔的生長,該海域滸苔生物量