丙泊酚對小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的影響

丙泊酚對小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的影響胰島素抵抗在危重病人中十分常見,嚴重影響危重病人的預后。丙泊酚可引起大鼠胰島素抵抗,但具體機制尚不清楚。為了從分子水平探討丙泊酚影響肝臟胰島素抵抗的機制,本研究以正常培養(yǎng)的小鼠原代肝細胞及TNF-α誘導產(chǎn)生胰島素抵抗的小鼠原代肝細胞為研究對象,檢測丙泊酚對胰島素信號通路關(guān)鍵酶磷酸化水平和細胞內(nèi)糖原水平的影響,結(jié)果顯示,丙泊酚可顯著降低正常培養(yǎng)小鼠原代肝細胞Akt(Ser473)和GSK-3p(Ser9)的磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路,抑制肝細胞糖原合成,從而引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗。對于TNF-α誘導產(chǎn)生胰島素抵抗的小鼠原代肝細胞,丙泊酚預處理可緩解TNF-α對小鼠原代肝細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路及糖原合成的抑制,提示丙泊酚對TNF-α導致的小鼠原代肝細胞胰島素抵抗有保護作用。在大多數(shù)手術(shù)、創(chuàng)傷和危重病(如燒傷、膿毒血癥)中胰島素抵抗是常見的一種代謝紊亂,并伴有高血糖。在危重病人(特別是手術(shù)病人)中,高血糖伴隨著死亡率上升、易感性增加、多發(fā)性神經(jīng)病變、腎功能不全、輸血需求增加、機械通氣時間延長、入住ICU需求增加和住院時間延長。有研究表明,通過胰島素強化治療來嚴格控制血糖可降低創(chuàng)傷感染的風險并降低ICU病人的發(fā)病率和死亡率；雖然也有與之有爭議的結(jié)果報道,但至少可以推測這些有爭議的結(jié)果部分是由于胰島素強化治療所引發(fā)嚴重低血糖的機率增高所致。有研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚麻醉可引起大鼠顯著的全身性胰島素抵抗,在丙泊酚麻醉大鼠的骨骼肌和心肌組織中由胰島素引起的葡萄糖攝取減少,肝糖輸出增加,結(jié)果表明在肌肉中由胰島素引起的葡萄糖攝取減弱及肝糖輸出抑制受損與丙泊酚引起的全身性胰島素抵抗有關(guān)。丙泊酚是目前最常用的靜脈麻醉藥,不僅用于各種手術(shù)的麻醉誘導和麻醉維持,而且還用于ICU病人的長時間鎮(zhèn)靜。丙泊酚在臨床上廣泛用于已知或未知患有胰島素抵抗的病人,但是排除手術(shù)應激及脂溶性載體等因素,單獨應用丙泊酚對胰島素信號通路及胰島素抵抗的影響尚無深入研究。丙泊酚是否會加重危重病人的胰島素抵抗?發(fā)生胰島素抵抗的危重病人輸注丙泊酚是否安全?在本研究中,我們選取胰島素作用的經(jīng)典靶器官肝臟,同時也是調(diào)控糖脂代謝最重要的臟器,觀察丙泊酚對小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的影響,探討丙泊酚影響肝臟胰島素抵抗的分子機制,為針對性地預防和治療危重病人胰島素抵抗提供更充分的科學依據(jù),同時指導我們在臨床麻醉工作中選擇合適的麻醉方式和麻醉用藥。第一章丙泊酚可引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗目的探討丙泊酚對小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的影響。方法采用MTT法檢測不同濃度丙泊酚培養(yǎng)條件下,小鼠原代肝細胞活力的變化。用終濃度為10μg/ml的丙泊酚處理小鼠原代肝細胞24h,Westernblot檢測PI3K/Akt/GSK-3β信號通路,蒽酮法檢測糖原合成。用終濃度為10μg/ml的丙泊酚處理小鼠原代肝細胞24h,Westernblot檢測PTEN蛋白含量,RT-PCR檢測PTENmRNA表達。所有數(shù)據(jù)代表3次獨立重復實驗所得樣本的均值。采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件(SPSSInc.,Chicago,USA),計量資料以均數(shù)±標準差(斑s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用Tukey檢驗。方差不齊時采用Welch校正,多重比較采用Tamhane’sT2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)(1～25μg/ml丙泊酚對小鼠原代肝細胞活性無顯著影響,但隨著丙泊酚濃度增高,小鼠原代肝細胞活性逐漸下降。當丙泊酚終濃度達到100μg/ml時,小鼠原代肝細胞活性下降至對照組的35±5%(P=0.000)。在明確不同濃度丙泊酚對小鼠原代肝細胞活力的影響后,根據(jù)實驗結(jié)果并結(jié)合臨床及相關(guān)文獻,選取10μg/ml丙泊酚終濃度,檢測不同培養(yǎng)時間下丙泊酚對小鼠原代肝細胞活力的影響,結(jié)果顯示培養(yǎng)32h后,小鼠原代肝細胞活力無顯著變化(P=0.949,F=0.216)。丙泊酚處理后pAkt(Ser473)和pGSK-3β(Ser9)相對降低,糖原合成減少；用丙泊酚(終濃度10μg/m1)和LiCl(終濃度20μmol/L)處理小鼠原代肝細胞24h,Propofol+LiCl組與DMSO組相比較,兩者在糖原合成上無顯著差異(P=0.649),在pGSK-3β(Ser9)/GSK-3p上無顯著差異(P=0.079),但在pAkt(Ser473)/Akt上兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)。丙泊酚處理后PTEN蛋白表達升高(P=0.001),PTENmRNA水平升高(P=0.026)。結(jié)論丙泊酚抑制小鼠原代肝細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路。丙泊酚可引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗。GSK-3β(Ser9)磷酸化受到抑制是丙泊酚抑制小鼠原代肝細胞糖原合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。丙泊酚引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的作用靶點在GSK-3β上游。丙泊酚從上游抑制了小鼠原代肝細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路。第二章PTEN基因沉默可逆轉(zhuǎn)丙泊酚引起的小鼠原代肝細胞胰島素抵抗目的探討PTEN在丙泊酚所致小鼠原代肝細胞胰島素抵抗中所起的作用及所處的位置,為治療丙泊酚的不良反應尋找可能的干預靶點。方法Cy3標記的siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細胞,用熒光顯微鏡觀察其亞細胞分布定位。在小鼠原代肝細胞中轉(zhuǎn)染公司合成的三段siRNA24h,設計并篩選得到有效干擾PTEN表達的siRNA片段。在小鼠原代肝細胞中同時加入丙泊酚(終濃度10gg/m1)和siR-996,培養(yǎng)24h,Westernblot檢測PI3K/Akt/GSK-3p信號通路,蒽酮法檢測糖原合成。所有數(shù)據(jù)代表3次獨立重復實驗所得樣本的均值。采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件(SPSSInc.,Chicago,USA),計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用Tukey檢驗。方差不齊時采用Welch校正,多重比較采用Tamhane’sT2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果Cy3標記的siRNA轉(zhuǎn)染10min后,在小鼠原代肝細胞中Cy3-siRNA的轉(zhuǎn)染效率大于95%。與negativecontrol組比,siR-996能夠最有效抑制PTEN表達,PTEN蛋白表達降低至對照組的51±5%(P=0.000),PTENmRNA水平降低至對照組的45+5%(P=0.000)。當PTEN基因沉默后,siR-996+Propofol組與NC+DMSO組相比較,兩者在糖原合成上無顯著差異(P=0.967),在pGSK-3β(Ser9)/GSK-3β上無顯著差異(P=0.846),在pAkt(Ser473)/Akt上無顯著差異(P0.757)。結(jié)論丙泊酚引起小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的作用靶點可能在PTEN或其上游。第三章丙泊酚對TNF-α導致的小鼠原代肝細胞胰島素抵抗有保護作用目的觀察丙泊酚對TNF-α導致的小鼠原代肝細胞胰島素抵抗的影響,探討丙泊酚影響肝臟胰島素抵抗的機制。方法用終濃度為10ng/ml的TNF-α處理小鼠原代肝細胞24h,Westernblot檢測PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,蒽酮法檢測糖原合成。用終濃度為10gg/ml的丙泊酚處理小鼠原代肝細胞6h,然后加入終濃度為10ng/ml的TNF-a處理小鼠原代肝細胞24h,Westernblot檢測PI3K/Akt/GSK-3p信號通路,蒽酮法檢測糖原合成。所有數(shù)據(jù)代表3次獨立重復實驗所得樣本的均值。采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件(SPSSInc.,Chicago,USA),計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用Tukey檢驗。方差不齊時采用Welch校正,多重比較采用Tamhane’sT2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果TNF-α處理24h后pAkt(Ser473)/Akt降低至對照組的45+12%(P=0.001),pGSK-3p(Ser9)/GSK-3(3降低至對照組的47±11%(P=0.001),糖原合成減少至對照組的49+10%(P=0.001)。用終濃度為10μg/ml的丙泊酚處理小鼠原代肝細胞6h,然后加入終濃度為10ng/ml的TNF-α處理小鼠原代肝細胞24h,Propofol+TNF-α組在PAkt(Ser473)/Akt、pGSK-3β(Ser9)/GSK-3β及糖原合成上均高于DMSO+TNF-α組(P=0.000;P=0.002；P=0.031)。結(jié)論用TNF-α處理小鼠原代肝細胞,可成功構(gòu)建胰島素抵抗的細胞模型。丙泊酚對TNF-α導致的小鼠原代肝細胞胰島素抵抗有保護作用,但這種保護作用并不是通過直接作用于PI3K-Akt信號通路實現(xiàn)的。全文結(jié)論1、丙泊酚抑制小鼠原代肝細胞PI3K/Akt/GSK-3β