多肽的酶法聚乙二醇透明質(zhì)酸定點修飾及初步藥學性質(zhì)研究

多肽的酶法聚乙二醇/透明質(zhì)酸定點修飾及初步藥學性質(zhì)研究多肽一般指α-氨基酸以肽鍵連接形成的化合物,其作為藥物具有生物功能明確、作用專一、毒性低等優(yōu)點,臨床上已被廣泛用于刺激造血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等。為克服其穩(wěn)定性差、半衰期短等缺點,以聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)等聚合物進行化學修飾被認為是簡單、有效的策略?？紤]到現(xiàn)有化學法修飾多肽藥物尚存在反應位點選擇性差、修飾率低及易導致活性損失等問題,我們嘗試采用酶催化法對多肽藥物進行PEG或透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)定點修飾,所采用的工具酶是一種來源于茂源鏈霉菌(Streptomcyesmobaraensis)的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbialtransglutaminase,mTGase)。mTGase可以催化谷氨酰胺(glutamine,Gln)的γ-甲酰胺基和賴氨酸(lysine,Lys)的伯胺基之間形成新的酰胺鍵。據(jù)此,本研究以含Gln或Lys殘基的胸腺五肽(thymopentin,TP5;氨基酸序列為RKDVY)、抗腫瘤多肽PCK3145(氨基酸序列為EWQTDNCETCTCYGT)以及設計的抗血管生成活性多肽ES2-TH(氨基酸序列為IVRRADRAAVPGGCGKRK)為研究對象,以末端功能化的PEG或HA為修飾劑,由mTGase催化進行位點特異性修飾;測定得到的PEG/HA-多肽綴合物的藥代動力學特征和體外活性,并比較與未修飾多肽的差異。本研究旨在利用mTGase酶催化實現(xiàn)多肽藥物的PEG/HA高效、定點修飾。本學位論文的研究內(nèi)容和取得的主要成果如下:1.PEG-多肽綴合物的酶法合成與表征(1)PEG-ZQG的合成與表征mTGase的二肽底物芐氧羰基-L-谷氨酰胺-甘氨酸(benzyloxycarbonyl-L-glutamine-glycine,ZQG)的羧基經(jīng)EDC/NHS活化后,與叔丁基胺聚乙二醇胺(BOC-PEG-NH2)的氨基反應得到PEG-ZQG,反應產(chǎn)率為75.3%。紫外-可見掃描譜圖顯示,PEG-ZQG與ZQG均在255nm處具有特征吸收峰;PEG-ZQG的1HNMR譜圖在δ=7.47-7.17ppm處新增ZQG苯環(huán)的特征信號峰,因此含單一Gln殘基的PEG-ZQG的合成成功。(2)PEG-TP5的制備與表征由于TP5含單一Lys殘基,故嘗試在mTGase的催化下,使之與PEG-ZQG的Gln殘基共價相連。反應液經(jīng)Superdex30凝膠柱純化得到產(chǎn)物(命名為PEG-TP5),反應產(chǎn)率為78.5%;HPLC分析表明PEG-TP5的純度為96.6%。與TP5類似,PEG-TP5的紫外-可見掃描譜圖顯示其于220nm和275nm處具特征吸收峰。其1HNMR譜圖在δ=7.02ppm和δ=6.73ppm處增加TP5酪氨酸殘基中苯環(huán)的特征信號峰;在δ=6.73ppm處增加了TP5纈氨酸殘基中兩個甲基的特征信號峰;與TP5的賴氨酸殘基側(cè)鏈C4-H的信號峰(δ=2.53ppm)相比,PEG-TP5對應的信號峰向低場移動(δ=3.18ppm),表明PEG-ZQG對TP5賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基實現(xiàn)定點修飾。綴合物中TP5的苯環(huán)氫信號峰和BOC-PEG-NH2的叔丁基氫信號峰(δ=1.32ppm)的積分比為0.41:1,由于每個TP5分子中含有4個芳香氫,每個BOC-PEG-NH2分子中含有9個叔丁基氫,可計算得綴合物的TP5與PEG分子數(shù)比為1:1。2.HA-多肽的酶法合成與表征(1)6-O-硫酸化HA的制備與表征HA先以離子交換法轉(zhuǎn)化為四丁基銨鹽,再以不同濃度的三氧化硫吡啶絡合物對其進行硫酸化修飾,得到不同硫酸化程度的硫酸化HA(sulfatedHA,SHA)。元素分析結(jié)果顯示SHA-1、SHA-2、SHA-3和SHA-4的硫氮原子比分別為0.0500、0.9333、1.453和2.888。其中SHA-2的1HNMR譜圖顯示位于δ=3.4ppm的C6-H的信號峰向低場移動,而C2-H、C3-H和C4-H的信號峰未發(fā)生明顯改變。因此,SHA-2為C6-OH定點硫酸化的HA衍生物。(2)HA-HMD的制備與表征由于HA結(jié)構(gòu)中無游離氨基,采用還原胺化反應于HA末端連接1,6-己二胺(hexamethylenediamine,HMD)。HA-HMD的1HNMR譜圖在δ=1.35ppm、δ=1.60ppm和δ=2.90ppm處出現(xiàn)三個積分值相近的信號峰,分別為HMD的α-H、β-H和γ-H的信號峰,表明HA-HMD的結(jié)構(gòu)與預期相符。(3)HA-ZQG的制備與表征采用合成PEG-ZQG類似的方法,使HA-HMD的末端氨基與ZQG的羧基共價相連制備HA-ZQG,反應產(chǎn)率為86.9%。HA-ZQG的1HNMR譜圖在δ=7.45-7.25ppm處新增苯環(huán)的特征信號峰,表明含Gln的HA-ZQG合成成功。(4)HA-TP5的制備與表征經(jīng)mTGase酶催化,TP5與HA-ZQG發(fā)生修飾反應,純化得到產(chǎn)物(HA-TP5),反應產(chǎn)率為82.7%,HA-TP5的純度為95.1%。HA-TP5的1HNMR譜圖在δ=7.02ppm和δ=6.73ppm處新增TP5酪氨酸殘基中苯環(huán)的特征吸收峰;在δ=3.78ppm處出現(xiàn)TP5氨基酸的α-H信號峰;在δ=0.99ppm處出現(xiàn)TP5纈氨酸的甲基信號峰,故TP5被HA共價修飾。綴合物中HA的異頭氫信號峰與氨基酸α-H信號峰積分值比例為1:0.29,由于每個TP5分子中含有5個α-H,每個HA分子中平均含18個異頭氫,計算得平均一分子HA連接1個TP5。(5)HA-PCK3145的制備與表征在mTGase催化下,嘗試以含伯氨基的HA-HMD修飾PCK3145的單一Gin殘基,純化得到新產(chǎn)物(HA-PCK3145),反應產(chǎn)率為81.7%,純度為88.3%。HA-PCK3145的1HNMR譜圖顯示在δ=8.32ppm處出現(xiàn)PCK3145酪氨酸和色氨酸的苯環(huán)特征吸收峰;δ=3.88-3.77ppm處出現(xiàn)PCK3145各個氨基酸的α-H信號峰,δ=2.51ppm處出現(xiàn)谷氨酸殘基、谷氨酰胺殘基和天冬氨酸殘基的特征信號峰,表明PCK3145的Gln殘基被HA定點修飾。綴合物中HA的異頭氫與氨基酸α-H的氫信號峰積分比例為1:0.8,由于每個PCK3145分子中含有15個α-H,每個HA分子平均含有18個異頭氫,可計算得平均一個HA上連接1個PCK3145多肽。(6)HA-ES2-TH的制備與表征以HA-HMD對ES2-TH的Lys進行修飾,純化得到新產(chǎn)物(HA-ES2-TH),反應產(chǎn)率為85.0%,純度為92.1%。HA-ES2-TH的1HNMR譜圖顯示的δ=3.76-3.94ppm的信號峰歸屬ES2-TH各個氨基酸α-H;在δ=2.56ppm處出現(xiàn)峰歸屬賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的與N或S原子直接相連的亞甲基;在δ=1.21ppm處出現(xiàn)的峰為異亮氨酸與纈氨酸中甲基的信號峰,表明ES2-TH被HA修飾成功。綴合物中HA的異頭氫與ES2-TH氨基酸的α-H信號峰的積分比例為1:1.24,由于每個ES2-TH含有18個α-H,每個HA分子中平均含有18個異頭氫,可計算得平均一個HA上連接1個ES2-TH多肽。(7)SHA-ES2-TH的制備與表征最后,以SHA-HMD修飾ES2-TH得到SHA-ES2-TH,反應產(chǎn)率為80.0%,純度為96.4%。SHA-ES2-TH的1HNMR譜圖顯示的δ=3.76-3.94ppm的多個小峰為ES2-TH各個氨基酸α-H的特征信號峰;在δ=2.56ppm處出現(xiàn)峰為賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的與N或S原子直接相連的亞甲基的信號峰;在δ=1.21ppm處出現(xiàn)的峰為異亮氨酸與纈氨酸中甲基的信號峰。綴合物中SHA的異頭氫與ES2-TH氨基酸α-H信號峰的積分比例為1:1.18,由于每個ES2-TH分子中含有18個α-H,每個SHA分子中平均含有18個異頭氫,可計算得平均一個SHA上連接1個ES2-TH多肽。3.多肽綴合物藥代動力學研究選用BALB/c小鼠作為動物模型,以尾靜脈單次給藥后,測定不同時間點的血清藥物含量以評價不同多肽綴合物的藥代動力學特征。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在小鼠體內(nèi)的藥代動力學行為均符合二室模型,根據(jù)其血藥濃度-時間曲線可知三者體內(nèi)分布半衰期t1/2q分別為0.5032min、4.257min和4.011min;消除半衰期t1/2β分別為29.45min、173.9min和224.5min,因此TP5經(jīng)PEG或HA修飾后,其半衰期均顯著延長。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在藥時曲線下面積AUCo-z分別為193.5μg·mL-1·min、924.2μg·mL-1·min和2382μg·mL-1·min,顯示PEG/HA-TP5的生物利用度較TP5顯著提高。與PCK3145相比,HA-PCK3145在小鼠體內(nèi)的t1/2α從22.37min延長至57.58min,t1/2β從219.5min延長至3032min,表明HA修飾的PCK3145半衰期顯著延長;與未修飾的PCK3145相比,HA-PCK3145的AUC0-z從1888μg·mL-1·min延長到6717μg·mL-1·min,表明修飾后的綴合物具有更高的生物利用度。與ES2-TH相比,HA-ES2-TH在小鼠體內(nèi)的t1/2α從17.46min延長至34.99min,t1/2β從243.3min延長至1703min,表明HA修飾的ES2-TH半衰期顯著延長;與未修飾的ES2-TH相比,HA-ES2-TH的AUC0-z從510.5μg·mL-·min延長到2958μg·mL-1·min,表明修飾后的綴合物具有更高的生物利用度。4.多肽綴合物體外活性的表征(1)PEG-TP5和HA-TP5的體外促淋巴細胞增殖活性采用MTT法測定TP5及PEG/HA-TP5體外對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。結(jié)果表明,濃度分別為18.4μmol·L-1、36.8μmol·L-1、73.5μmol·L-1和147.1μmol·lL-1的TP5、PEG-TP5和HA-TP5在體外均具有顯著的刺激淋巴細胞增殖的活性(P<0.05);PEG-TP5、HA-TP5的促淋巴細胞增殖率與相同濃度的TP5相比無顯著差異(P>0.05),因此IP5由mTGase催化進行PEG或HA修飾,對其體外免疫活性影響不大。(2)HA-PCK3145的體外抗腫瘤細胞增殖活性采用MTT法評價HA-PCK3145體外抗人乳腺癌細胞增殖作用。結(jié)果表明,濃度分別為14.26μmol·L-1、28.52μmol·L-1、57.04μmol·L-1和114.09μmol·L-1的PCK3145和HA-PCK3145體外均具有極顯著的抗人乳腺癌細胞增殖作用(P<0.01);相同濃度的HA-PCK3145與PCK3145的抗腫瘤細胞增殖活性相當(P>0.05),因此PCK3145由mTGase催化進行HA修飾對其體外抗腫瘤活性影響不大。(3)HA-ES2-TH的體外抗血管內(nèi)皮細胞增殖活性采用MTT法評價HA-ES2-TH體外抗血管內(nèi)皮細胞增殖作用。結(jié)果表明,濃度分別為26.18μmol·L-1、52.36μmol·L-1和104.71μmol·L-1時,ES2、ES2-TH和HA-ES2-TH在體外均具有極顯著的抗血管內(nèi)皮細胞