丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的抑制作用及相關機制研究

丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的抑制作用及相關機制研究第一部分:丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療作用目的建立可逆性膽堿酯酶抑制劑匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（StatusEpilepticus,SE）模型,觀察不同劑量靜脈麻醉藥丙泊酚在癲癇發(fā)作后30min給藥對大鼠SE的影響。方法在大鼠上建立氯化鋰（3mmol/kg）-匹魯卡品（30mg/kg）誘發(fā)SE模型,以行為學、腦電圖（electroencephalogram,EEG）上典型癲癇波的變化、動物24h存活數(shù)及皮層和海馬的病理變化為觀察指標,評價比較不同劑量（mg/kg）丙泊酚（12.5、25、50、75及100）,安定（10）、東莨菪堿（10）及MK-801（2）對SE的抑制作用。結果1.氯化鋰（3mmol/kg）-匹魯卡品（30mg/kg）可誘發(fā)SE,給予匹魯卡品后15min,動物開始出現(xiàn)行動遲緩、呆滯,面部抽搐、點頭樣運動、尾巴僵直并翹尾,20-25min后開始出現(xiàn)四肢強直性抽搐,最后發(fā)展成為以持續(xù)性全身性強直發(fā)作為特征的SE,在EEG上可觀察到SE所特有的、持續(xù)的高幅高頻驚厥波。2.行為學及EEG結果顯示,丙泊酚（50～100）mg/kg對SE具確切治療效果,并可顯著降低SE動物死亡數(shù)（P＜0.05）。3.SE出現(xiàn)后30mini.p.東莨菪堿（10mg/kg）、MK-801（2mg/kg）及安定（10mg/kg）,除東莨菪堿外,MK-801及安定對SE亦有較為明顯抑制作用,其抗驚效果與丙泊酚中、高劑量組相當。4.HE染色結果顯示,SE反復發(fā)作24h后皮層和海馬CA1區(qū)細胞數(shù)明顯減少,有的細胞腫脹破裂,輪廓模糊界限不清,排列紊亂,而海馬其它各區(qū)變化不甚明顯。丙泊酚組、DZP組和MK-801組細胞數(shù)較SE組明顯增多（P＜0.05）。結論1.氯化鋰（3mmol/kg）-匹魯卡品（30mg/kg）可誘發(fā)典型的SE狀態(tài),SE發(fā)作后24h皮層和海馬可見明顯的細胞損傷。2.丙泊酚對氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)的SE具有確切的治療效果,可明顯改善EEG變化,增加出現(xiàn)SE動物24h存活數(shù),改善皮層和海馬細胞的損傷程度,提示丙泊酚在SE治療上具潛在應用價值。第二部分:丙泊酚對致死劑量NMDA中毒小鼠的保護作用目的:建立N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）致死模型,觀察丙泊酚對致死劑量NMDA中毒小鼠的保護作用。方法:給予致死劑量NMDA前10min,腹腔注射不同劑量（mg/kg）丙泊酚12.5、25、50、75及100,NMDA受體拮抗劑MK-801（2mg/kg）及等容積脂肪乳（丙泊酚溶劑）,以中毒動物存活率為評價指標,觀察上述藥物對致死劑量NMDA中毒小鼠的保護作用。結果:腹腔注射NMDA175mg/kg可導致小鼠全身驚厥發(fā)作及快速死亡;丙泊酚（12.5,25,50,75及100mg/kg）可劑量依賴性抑制NMDA致死效應,顯著降低中毒小鼠死亡率;其作用類似于NMDA受體拮抗劑MK801（存活率100%）;而脂肪乳對致死劑量NMDA中毒小鼠無保護作用。結論:丙泊酚（12.5～100）mg/kg可劑量依賴性的對抗NMDA誘發(fā)的致死效應;丙泊酚可能存在對NMDA受體的直接或間接拮抗作用。第三部分:丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)SE大鼠皮層和海馬NMDA受體亞型表達的影響目的在大鼠上建立可逆性膽堿酯酶抑制劑匹魯卡品誘發(fā)SE模型,觀察丙泊酚對SE大鼠皮層和海馬NMDA受體亞型（2A,2B）表達的影響。方法60只SD大鼠隨機分為6組,分別為空白對照組（BLK組）、SE組（SE組）、丙泊酚50mg/kg組（PPF組）、安定10mg/kg組（DZP組）、東莨菪堿10mg/kg組（SCOP組）及MK-801（2mg/kg）組（MK-801組）。除BLK組外,其他各組大鼠均給予氯化鋰（3mmol/kg）及匹魯卡品（30mg/kg）,建立匹魯卡品誘發(fā)SE模型。待SE出現(xiàn)后30min,各治療組動物分別腹腔注射丙泊酚等治療藥物及等容量生理鹽水（BLK組和SE組）。24h后,將存活動物分兩批處理,每組取3只大鼠進行心臟灌注后取大腦行免疫組化分析;剩余大鼠（每組取4只）斷頭取腦,快速剝離皮層和海馬進行蛋白免疫印跡（WesternBlot）分析。采用免疫組化和WesternBlot法觀察丙泊酚對SE大鼠發(fā)作24h后皮層和海馬NMDA受體2A、2B亞型表達的影響。結果1.SE反復發(fā)作后24h,與BLK組相比,SE組大鼠皮層和海馬NMDA受體2A、2B亞型陽性細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）;2.與SE組相比,丙泊酚50mg/kg給藥組動物皮層和海馬NMDA受體（2B）亞型表達顯著降低（P＜0.05）。免疫組化結果發(fā)現(xiàn),在海馬區(qū)NR2B亞型表達顯著降低,陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）;而NMDA受體2A亞型在各區(qū)表達均無明顯變化。3.MK-801（2mg/kg）可顯著降低皮層和海馬NMDA受體2A、2B亞型的表達,與SE組相比有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）,但安定（10mg/kg）和東莨菪堿（10mg/kg）對NMDA受體2A和2B亞型無明顯影響。結論1.SE出現(xiàn)后24h,皮層和海馬NMDA受體（2A和2B）亞型表達顯著上調(diào)。2.丙泊酚可顯著抑制皮層和海馬NMDA受體2B亞型表達,但對NMDA受體2A亞型表達無明顯影響,其作用與特異性NMDA受體拮抗劑MK-801類似,但與GABA受體激動劑安定及抗膽堿藥東莨菪堿存在顯著差別;3.丙泊酚對擬膽堿藥匹魯卡品誘發(fā)SE的抑制作用可能與其下調(diào)NMDA受體2B亞型的表達有關。第四部分:丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)SE大鼠大腦皮層和海馬GABA_A受體α₁亞型表達的影響目的建立可逆性膽堿酯酶抑制劑匹魯卡品誘發(fā)大鼠SE模型,觀察丙泊酚對匹魯卡品誘發(fā)SE大鼠皮層和海馬GABAA受體α₁亞型表達的影響。方法50只SD大鼠隨機分為5組,包括空白對照組（BLK組）、SE組（SE組）、東莨菪堿10mg/kg組（SCOP組）、丙泊酚50mg/kg組（PPF組）及安定10mg/kg組（DZP組）。除BLK組外,其他各組動物均腹腔注射氯化鋰（3mmol/kg）-匹魯卡品（30mg/kg）,建立匹魯卡品誘發(fā)SE模型。待SE出現(xiàn)后30min,分別給予丙泊酚50mg/kg、東莨菪堿10mg/kg及安定10mg/kg等不同治療藥物,空白對照組和模型組給予等量的生理鹽水。24h后,取3只大鼠進行心臟灌注后取皮層和海馬行免疫組化分析;剩余大鼠行蛋白免疫印跡分析（WesternBlot）。采用免疫組化和WesternBlot法觀察丙泊酚對SE大鼠發(fā)作24h后皮層和海馬GABA_A受體α₁亞型表達的影響。結果1.SE出現(xiàn)后24h,皮層和海馬GABA_A受體α₁亞型表達均顯著降低,與BLK組相比有顯著差異（P＜0.05）;2.丙泊酚50mg/kg可顯著上調(diào)皮層和海馬GABA_A受體α₁亞型表達,與SE組相比有顯著差異（P＜0.05）;其作用類似于GABA受體激動劑安定（10mg/kg）,而東莨菪堿（10mg/kg）對GABA_A受體α₁亞型無明顯影響。結論1.SE出現(xiàn)后24h,GABA_A受體α₁亞型表達下調(diào)。2.丙泊酚可顯著上調(diào)GABA_A受體α₁亞型表達。第五部分:丙泊酚治療癲癇持續(xù)狀態(tài)的抗氧化機理研究目的在大鼠上建立可逆性膽堿酯酶抑制劑匹魯卡品誘發(fā)SE模型,觀察丙泊酚對SE大鼠血清、皮層和海馬超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平的影響。方法72只SD大鼠隨機分為6組,包括空白對照組（BLK組）、SE組（SE組）、丙泊酚50mg/kg組（PPF組）、安定10mg/kg組（DZP組）、東莨菪堿10mg/kg組（SCOP組）及MK-801（2mg/kg）組（MK-801組）。待SE出現(xiàn)后30min,分別給予不同藥物及等容積生理鹽水。采用分光光度法測定給藥后2h及24h動物血清、海馬及皮層內(nèi)SOD、GSH及MDA值。結果1.SE發(fā)作后30min給予各實驗用藥（BLK組和SE組給予等容量的生理鹽水）,給藥后2h,SE組血清、皮層及海馬內(nèi)SOD及MDA水平顯著升高,GSH含量顯著降低,與BLK組相比有顯著差異（P＜0.01）;2.與SE動物相比,丙泊酚給藥組動物SOD無明顯改變,但GSH可顯著升高而MDA含量顯著降低（P＜0.01）;但安定、東莨菪堿及MK-801給藥組動物與SE組動物相比無顯著改變。3.給藥后24h,血清、皮層及海馬內(nèi)SOD、MDA及GSH水平與給藥后2h存在類似變化,與BLK組相比具顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;4.給藥后24h,與模型組動物相比,丙泊酚給藥組動物血清及皮層、海馬內(nèi)GSH顯著增高,MDA顯著降低（P＜0.01）,但SOD