輔助生殖科輔助生殖臨床技術操作規(guī)范

輔助生殖科輔助生殖技術操作規(guī)范

目錄第一篇輔助生殖臨床應用第一章取卵手術 第一節(jié)、取卵手術常規(guī) 第二節(jié)、取卵手術負壓吸引器調(diào)節(jié)程序 第二章．冷凍胚胎移植 第一節(jié)、冷凍胚胎移植的內(nèi)膜準備 第二節(jié)、胚胎移植手術 第三節(jié)、驗孕和孕期監(jiān)測 第三章．宮腔內(nèi)人工授精常規(guī) 第一節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的必備條件 第二節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的適應癥 第三節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的禁忌癥 第四節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精促排卵常規(guī) 第二篇 輔助生殖實驗室部分第一章. 精液檢查及精子制備第一節(jié)、 精液常規(guī)檢查操作方法第二節(jié)、 精子形態(tài)分析操作方法第三節(jié)、 精子低滲腫脹試驗(HOS)第四節(jié)、 全自動精子分析系統(tǒng)使用說明(西班牙SCA全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)) 第五節(jié)、 抗精子抗體(MAR)檢測方法第六節(jié)、 細針附睪/睪丸穿刺取精術及精子制備常規(guī)第七節(jié)、 伊紅試驗第二章. 宮腔內(nèi)人工授精的實驗室處理第一節(jié)、 取精第二節(jié)、 精液處理第三節(jié)、 授精第四節(jié)、 文件書寫第三章. 體外受精-胚胎移植常規(guī)第一節(jié)、 儀器準備(最遲提前2天)第二節(jié)、 試劑第三節(jié)、 所需物品第四節(jié)、 步驟第四章. 卵細胞漿內(nèi)單精子注射常規(guī)第一節(jié)、 儀器配置及注射前準備第二節(jié)、 卵細胞漿內(nèi)精子注射的適應癥第三節(jié)、 ICSI操作程序第五章. 卵子輔助激活常規(guī)一、卵子輔助激活指征二、激活試劑配制三、步驟第六章. 玻璃化冷凍解凍常規(guī)一、冷凍解凍試劑配制二、冷凍操作常規(guī)三、解凍操作常規(guī)第七章.精子冷凍一、新鮮精子冷凍二、睪丸及附睪精子冷凍第三篇輔助生殖并發(fā)癥的防治 第一節(jié)、取卵術手術并發(fā)癥及處理第二節(jié)、減胎術概述第三節(jié)、卵巢過度刺激綜合征診療常規(guī)第四節(jié)、異位妊娠診療常規(guī)第五節(jié)、感染的診療常規(guī)第六節(jié)、臟器損傷的診療常規(guī)第七節(jié)、血管損傷的診療常規(guī)第八節(jié)、卵巢扭轉(zhuǎn)的診療常規(guī)

第一篇輔助生殖臨床應用第一章取卵手術技術第一節(jié)、取卵手術常規(guī)1)精神緊張者可使用杜冷丁鎮(zhèn)痛，用法為50mg肌注，注藥前病人解小便，若既往注射度冷丁后嘔吐嚴重則禁用。2)打開加熱臺開關，如果需要沖洗，打開沖洗機，使注射腔預熱(見附錄)。3)手術者及器械護士洗手，注意擦第二遍滅菌王后用滅菌毛巾準備好所用物品(見附錄)。4)進手術室前給病人肌注將手擦干。5)器械護士穿手術衣，戴手套、生理鹽水洗手，將14mlFalcon管平放于取卵加熱臺上，并用無菌巾蓋好，使取卵管預溫。6)手術者戴手套，打開陰道消毒包,用10ml注射器抽1%利多卡因，放臺上備用。7)手術者用PVP碘消毒外陰、陰道，用生理鹽水沖洗陰道至碘全部沖盡(紗布不變色)。8)陰道沖洗后用干紗布將陰道擦干，于宮頸基底3點9點處各注射1%利多卡因5ml。注意注藥前要回抽，證實未刺入血管后再推藥。9)手術者穿手術衣，換干凈手套,生理鹽水洗手。11)器械護士、手術者、巡回三者協(xié)同上陰道探頭套及布套,注意無菌操作。12)生理鹽水紗布擦洗探頭套。13)生理鹽水沖洗穿刺架，上穿刺架,作盆腔掃描。14)撕開穿刺針袋，手術護士將穿刺針從袋內(nèi)取出，立即將取卵管套在膠塞上(注意不可碰觸膠塞的內(nèi)面)。將穿刺針與負壓吸引管連接，按負壓調(diào)節(jié)程序調(diào)負壓至15Kpa。15)若需卵泡沖洗，此時通知實驗室將裝有沖洗液的60ml注射器遞出交巡回與沖洗管連接并安裝于沖洗機上。16)管道沖洗：巡回從操作箱內(nèi)取出沖針液，手術者將穿刺針插入試管中吸出1-2ml沖針液使管道溫度及PH平衡，吸出之沖針液連同取卵試管應棄去.若為雙腔針可先沖再吸。余下的沖針液應立即放回操作箱.若為含Hepes之沖針液,蓋子應蓋緊；若為碳酸氫鹽緩沖的沖針液,放回操作箱前蓋子松開。17)通知實驗室，若實驗室已做好準備可開始卵泡穿刺。當一側(cè)卵巢卵泡穿刺完畢后應取出穿刺針，經(jīng)沖洗液沖洗后，將穿刺針插入保護套內(nèi)，待實驗室找卵近結束時再次沖洗取卵針并開始下一側(cè)卵巢的穿刺。18)手術護士應注意手術臺溫度和取卵管溫度，注意負壓系統(tǒng)工溫度下降太快,應關閉風機或升高室溫。19)手術過程中若出血多，可將陰道探頭緊壓于陰道穹隆數(shù)分鐘，一般出血會立即停止。20)若卵巢位于子宮上方，可采取以下方法避免經(jīng)子宮穿刺：腹部按壓,改變探頭方位，牽拉宮頸。若上述措施無效,可經(jīng)子宮穿刺，但應避免經(jīng)過內(nèi)膜。21)取卵完畢后，常規(guī)盆腔掃描并做陰道檢查,若有出血做相應處理。22)術者填寫《取卵手術記錄》。附錄：取卵手術物品取卵手術物品1.洗手、消毒物品①洗手用品②陰道消毒包③溫生理鹽水8瓶④漏斗、塑料桶2只2.消毒巾①塑料布②手術衣、口罩、帽子③消毒手套④孔巾、腳套⑤陰道探頭布套3.手術車、消毒車4.穿刺物品①取卵針(16G或17G，根據(jù)情況而定)②陰道探頭套③吸引管④消毒玻璃接頭⑤14毫升FALCON管若干(根據(jù)卵泡多少定)⑥16G穿刺支架⑦消毒試管架⑧5毫升注射器，60毫升注射器5.其它①手術燈②吸引器③B超儀④椅子⑤加熱臺第二節(jié)、取卵手術負壓吸引器調(diào)節(jié)程序負壓吸引器工作狀態(tài)好壞對取卵影響很大，取卵術前、術中應注意觀察：1)連接負壓吸引管前應先試機，當按住進氣口(玻璃接頭)時負壓應上升至15Kpa。開放進氣口，再反復試三次。若負壓不在15Kpa應調(diào)節(jié)負壓調(diào)節(jié)旋鈕。最大負壓達不到15Kpa，可能提示吸引膠管漏氣，接頭連接不緊或吸引器已損壞，此種情況應調(diào)換吸引器。2)將吸引器玻璃接頭與吸引管緊密連接，再將吸引管玻璃接頭與取卵針連接，取卵針膠塞與取卵管接緊，各接頭處不可漏氣。3)吸空針(CCD17G單腔針)負壓應達到5Kpa，否則表明負壓系統(tǒng)有問題，反復試三次。4)吸培養(yǎng)基，負壓應接近15Kpa，且培養(yǎng)基呈線狀流入取卵管。若負壓達15Kpa但培養(yǎng)液不呈線狀流入，表明取卵針已不通暢，應換針。5)取卵過程中若穿刺針進入卵泡中很順利，但卵泡液流出緩慢或卵泡縮小緩慢，表明負壓系統(tǒng)有問題或穿刺針阻塞，應立即檢查原因，并作相應處理。6)若取卵率低，應首先檢查負壓吸引系統(tǒng)。7)負壓吸引器放在手術臺上，取卵過程中巡回；手術護士、手術者應反復觀察壓力表顯示。說明：a、負壓吸引器為XX醫(yī)用吸引器廠生產(chǎn)的羊水吸引器，型號YB-DYX-1。在0-25Kpa內(nèi)可調(diào)另購腳踏開關與吸引器連接，腳踏開關電線長2米。b、壓力旋鈕平時放強檔，使用時旋轉(zhuǎn)微旋鈕調(diào)節(jié)壓力。c、使用時去掉負壓吸引瓶，吸引器進氣管通過鹽水接頭直接與無菌吸引管連接。d、吸引器進氣管(綠色)不耐紫外線，應用膠帶保護。沖洗機調(diào)節(jié)方法：①移動顯示條按A②顯示移動條內(nèi)容按B③移動黑方塊按A④改數(shù)字按數(shù)字鍵⑤輸入設定內(nèi)容按“Enter”⑥使活塞后退再開門一次。

第二章冷凍胚胎移植技術操作規(guī)范“以冷凍胚胎移植為核心的IVF策略”不同于傳統(tǒng)超排卵周期因卵泡多為防止OHSS或因孕酮高不適合新鮮胚胎移植不得已而采用全胚冷凍?！耙岳鋬雠咛ヒ浦矠楹诵牡腎VF策略”是主動的全胚冷凍，包含四個基本要素：簡單的促排卵方案、全胚冷凍、主要在自然排卵周期進行冷凍胚胎移植、簡單的黃體支持。冷凍胚胎移植涉及以下關鍵問題：內(nèi)膜準備、胚胎內(nèi)膜同步、黃體支持。第一節(jié)、冷凍胚胎移植的內(nèi)膜準備冷凍胚胎移植可以在自然周期、微刺激周期和激素替代周期進行，前兩種稱為有排卵周期。排卵后有黃體形成，移植后黃體支持簡單，應該盡量在有排卵周期進行冷凍胚胎移植。一、自然排卵周期內(nèi)膜準備適用于排卵正常，周期23-30天的婦女。月經(jīng)周期第10天前排卵的婦女不適合自然周期冷凍胚胎移植，可以用來曲唑推遲排卵2天。周期超過30天的婦女監(jiān)測時間較長，也可以用來曲唑促排卵，縮短監(jiān)測次數(shù)。準備自然周期冷凍胚胎移植的患者，根據(jù)月經(jīng)周期長短從月經(jīng)周期第10天-12天開始用尿LH試紙監(jiān)測，每天一次，用晨尿測定。若LH開始顯示，來院抽血查性激素：FSH,LH,E2，P4，同時超聲監(jiān)測，注意內(nèi)膜厚度、形態(tài)、卵泡大小、有無輸卵管積水。注意少數(shù)婦女LH峰不典型，尿LH測定一直陰性，若LH一直陰性，月經(jīng)周期第14-15天來院查性激素和超聲監(jiān)測。1、若血LH水平超過10miu/ml，E2超過200pg/ml，且內(nèi)膜超過8mm，形態(tài)正常，卵泡平均直徑大于16mm，標志著LH峰已經(jīng)出現(xiàn)。2、若血LH超過10miu/ml，但小于20miu/l，E2、P4仍低，卵泡平均經(jīng)線小于15mm，應該第二天復查，判斷LH峰是否真正發(fā)生。3、若血LH水平低于20mIU/ml,且P4低于1ng/ml,即LH處于上升期，當日夜晚9點注射HCG10000U，+5天上午9-10點解凍D3胚胎，+7天上午9-10點解凍D5-7囊胚4、LH水平等于或大于20mIU/ml,或P4大于等于1ng/ml,即LH峰處于下降期，當日下午2-5點注射HCG10000U，+4天上午9-10點解凍D3胚胎，+6天上午9-10點解凍D5-7D囊胚。5、若已經(jīng)排卵、P4在1-2ng/ml之間，為排卵第一天，立即注射HCG10000U，同時開始使用達芙通和安琪坦或雪諾酮，+3天上午9-10點解凍D3胚胎，+5天上午9-10點解凍D5-7D囊胚。一般口服達芙通支持黃體已經(jīng)足夠，不再監(jiān)測內(nèi)源性孕酮，不注射黃體酮油劑，方便病人。6、夜晚9點注射HCG10000U的，+3天開始口服達芙通下午2-5點注射HCG10000U的，+2天開始口服達芙通(達芙通用量20mgBIDPO)。7、若注射HCG日卵泡平均直徑低于15mm，可能發(fā)生黃體功能不全，應該加強黃體支持，口服達芙通同時陰道塞黃體酮，如安琪坦0.2gbidpv，或雪諾酮1支pv。8、注射HCG后到移植日不再監(jiān)測，移植日測內(nèi)膜，移植后不監(jiān)測內(nèi)源性孕酮和雌激素。9、取消移植標準：E2高峰日，或冷凍胚胎移植日內(nèi)膜厚度低于8mm；E2高峰值低于150pg/ml，LH峰日卵泡小于14mm，或不能確定排卵時間，或內(nèi)膜形態(tài)異常均應該取消移植。二、微刺激周期的內(nèi)膜準備1、來曲唑微刺激(來曲唑的用量應根據(jù)月經(jīng)周期長短決定)：①周期30--34天，來曲唑第一周期用量2.5mgqd3天。②周期35--40天，來曲唑第一周期用量5mgqd3天。③周期超過40天，來曲唑第一周期用量5mgqd5天。④周期第10天前排卵，或卵泡14mm以下排卵的婦女，可以用來曲唑推遲排卵。來曲唑2.5mgqd3天。來曲唑用量越大需要添加的HMG用量越少，卵泡越少，雌激素越低來曲唑用量越小--需要添加的HMG用量越大，卵泡越多，雌激素越高。一般從月經(jīng)周期第3天開始口服來曲唑，用藥起始日后7天超聲監(jiān)測：主卵泡超過14mm,不需要加用HMG主卵泡不足14mm，加用HMG150uimqod,2-3次復診2、HMG晚刺激若月經(jīng)第12天主卵泡小于10mm，用HMG促排卵，HMG150imqod，根據(jù)卵泡的大小決定用藥次數(shù)，促排卵的同時監(jiān)測尿LH。一般HMG晚刺激周期卵泡在15mm出現(xiàn)LH峰。無論是自然周期還是微刺激周期做內(nèi)膜準備，均采用嚴格同步的方法，同步方式和黃體支持同自然周期。三、激素替代周期的內(nèi)膜準備為減少病人痛苦，盡量不采用激素替代做冷凍胚胎移植，HRT有指證進行。適用于：①FET反復自然周期失敗；②.不明原因不孕自然周期FET失??；③自然周期內(nèi)膜<6mm；④周期<23d、周期第10天前排卵或卵泡<14mm有LH峰出現(xiàn)者；⑤異常出血(排卵期出血、經(jīng)期延長)的患者。內(nèi)膜薄、異常出血的患者應該先做宮腔鏡，有排卵周期胚胎移植失敗的患者、有人工流產(chǎn)史、宮腔手術史、結核史的患者應該先做宮腔鏡檢查。激素替代前一般不需要降調(diào)節(jié)，從月經(jīng)周期第3天直接使用雌激素。子宮肌腺癥是否需要在激素替代前作降調(diào)節(jié)沒有確切的證據(jù)，如果內(nèi)膜正常，子宮肌腺癥患者在激素替代前沒有降調(diào)節(jié)的必要。為有效抑制卵泡發(fā)育，使用乙炔雌二醇25微克tidpo14天，若患者對乙炔雌二醇胃腸道反應嚴重可以換成芬嗎通紅色片，4mgbidpo14天。應用雌激素14天后超聲監(jiān)測內(nèi)膜厚度、形態(tài)，注意有無卵泡發(fā)育。血激素檢查注意孕酮水平，如果孕酮超過1.0n/ml，周期取消。如果內(nèi)膜厚度達到8mm、孕酮未升高可以考慮使用孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，或根據(jù)工作安排決定開始使用孕激素進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化的時間。如果使用14天雌激素后內(nèi)膜達不到8mm，并且無卵泡發(fā)育、無孕酮升高，應該延長雌激素使用時間：維持原來的雌激素劑量不變，同時加用芬嗎通白色片1mgqnpv,阿司匹林50mgbidpo防止血栓。1mg芬嗎通陰道塞藥血清雌二醇水平可以達到100-1500pg/ml。特別注意向患者交代在孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜前不可以使用含有地屈孕酮的芬嗎通灰色片。激素替代最長可以達到35天，過長時間的雌激素使用內(nèi)膜突破性出血的可能性大大增加。達到上述使用孕激素轉(zhuǎn)化的標準后，停止使用原來口服的雌激素，口服芬嗎通黃色片2片bidpo，同時陰道塞黃體酮(安琪坦0.2gbidpv，或雪諾酮1支pv)，維持原來陰道使用的芬嗎通塞藥，和阿司匹林。決定內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日，+3天上午9-10點解凍D3胚胎，+5天上午9-10點解凍D5-7D囊胚。不監(jiān)測外周血孕酮。四、尿LH測定為了提高就診效率、優(yōu)化就診流程，尿LH檢測不失為一種輔助醫(yī)生做出判斷和處理的有效手段。通常情況下，采用輕微刺激、人工授精、自然周期等促排卵方案時，因監(jiān)測頻度稍高，為了減少等待時間，采用血激素和尿LH測定相結合的方法，可以提高就診效率。進行卵泡期非降調(diào)節(jié)的促排卵或自然周期監(jiān)測的患者，應常規(guī)監(jiān)測尿LH，開好尿LH試紙后，根據(jù)月經(jīng)周期長短和具體促排卵方案告知患者開始測尿LH的時間和方法。尿LH的檢測方法是否正確尤為重要，醫(yī)護人員應告知患者檢測時要看到尿液被吸進觀察窗，方能取出，應5分鐘后觀察，若觀察太早不易發(fā)現(xiàn)LH峰，容易漏診，早晚各測1次LH試紙更易發(fā)現(xiàn)LH的變化。很多人可能不會出現(xiàn)說明書上提示的強陽性，即T和C線深淺相同，所以要提醒患者不能等強陽就診，否則會錯過排卵時間。醫(yī)護人員應告知患者復診當日攜帶尿LH試紙給主管醫(yī)生看，以利于主管醫(yī)生快速做出判斷，減少患者在醫(yī)院的等候時間，提高就診效率。有關尿LH的具體測試方法和注意事項參看黃體期促排卵章節(jié)的有關部分。第二節(jié)、胚胎移植手術一、胚胎移植基本原則胚胎移植是影響輔助生殖技術效率的重要環(huán)節(jié)，胚胎移植技術的好壞直接影響到試管嬰兒的成功率，因此參與胚胎移植的實驗室和臨床工作人員都應重視胚胎移植的規(guī)范操作。移植時間：移植時間應根據(jù)冷凍胚胎的內(nèi)膜準備所述的方法進行。1、移植胚胎數(shù)：挑選形態(tài)最佳的胚胎做移植，移植分裂期胚胎不超過2個，移植囊胚不超過2個。移植胚胎的數(shù)量應征求病人的意見，告知多胚胎移植可能發(fā)生多胎妊娠。胚胎評價及分級標準見附錄。操作要點：移植過程的各個操作應輕柔，努力做到無損傷操作。2、移植前準備：①移植當天早上8點陰道超聲檢查內(nèi)膜厚度、有無宮腔積液，若有輸卵管積水則在移植前抽掉積水；確認無誤通知實驗室開始解凍胚胎；②根據(jù)當日取卵手術量決定具體移植時間并告知病人，胚胎解凍后談話簽字，向病人交待胚胎移植前需充盈膀胱。③通知實驗室具體的胚胎移植時間，以便實驗室作相應準備。包括：預溫一個4孔培養(yǎng)皿、巴士德管、毛細巴士德管、胚胎移植內(nèi)管；胚胎移植前日將移植液放培養(yǎng)箱內(nèi)平衡至少8小時等。④移植前陰、腹B超檢查，觀察子宮位置、屈度、從宮頸外口到宮腔底部長度、子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)、有無宮腔積液、卵巢大小、有無輸卵管積液、有無盆腔積液等。若有宮腔積液則應抽除積液并推遲移植。若有過激表現(xiàn)則取消移植。決定推遲移植或取消移植的病例，臨床醫(yī)生應將決定通知實驗室。內(nèi)膜厚度低于5mm或發(fā)生過早LH峰可不做新鮮胚胎移植所有胚胎于原核期進行冷凍保存。二、胚胎移植過程物品：胚胎移植包、胚胎移植管、孔巾、溫生理鹽水、慶大霉素8萬單位、漏斗、帶腹部探頭的B超。1、陰道準備：患者膀胱截石位上身平臥，術者帶無菌手套，生理鹽水擦洗外陰后鋪孔巾，上窺陰器，生理鹽水加慶大霉素擦洗陰道及頸管，注意應可能的將宮頸粘液清除但需避免頸管出血，若宮頸粘液多可用胚胎移植管的外套管插入宮頸管內(nèi)將粘液吸出(做移植時應使用新的外套管)。2、助手腹部超聲做子宮掃描，縱切子宮顯示離宮底3CM處即為外套管最深點(TDT管)。3、插外套管：胚胎移植管拆封后移植內(nèi)管連同其包裝袋遞交給實驗室放胚胎操作箱內(nèi)保溫，外套管交術者，注意拿外套管時術者不可碰觸導管前后端。取出外套管內(nèi)芯在腹部超聲引導下將外套管插入到距宮底3cm處，并通知實驗室外管已插好，實驗室開始裝胚胎。若不用內(nèi)芯插管困難可上宮頸鉗牽拉宮頸，重新插管；若仍插管困難加用內(nèi)芯用無菌紗布包裹移植管外管前端做適當彎曲后插管；若仍很困難可嘗試更換窺陰器、腹部按壓、改變體位后插管，若仍無效應推遲一天移植，次日移植前口服安定5毫克或在麻醉下移植。4、裝胚胎：當臨床醫(yī)生開始做插管前準備時實驗室人員做移植準備，打開胚胎實驗室內(nèi)、外門，操作箱充氣后將移植液取出，在操作箱內(nèi)用經(jīng)過移植液洗滌的巴士德管將移植液吸出加入到四孔培養(yǎng)皿的1-3號孔中，各孔的液體量分別為0.5-0.8ml、0.8ml、0.5ml，將胚胎從培養(yǎng)箱內(nèi)取出置操作箱內(nèi)，用經(jīng)移植液洗滌的毛細巴士德管將待移植的胚胎轉(zhuǎn)移到3號孔中經(jīng)洗滌后轉(zhuǎn)移到1號孔中，集中放置在9點位置。取一個1mlBD注射器，反復抽拉活塞，去針頭將注射器接到胚胎移植管內(nèi)管上，將內(nèi)管從保護套內(nèi)取出，尖端置入2號孔內(nèi)，上抽注射器活塞將0.3-0.5ml移植液吸入到內(nèi)管及注射器內(nèi)，當注射器內(nèi)液面不在上升時拔出注射器，將注射器直立上推活塞排除氣泡，再將注射器與內(nèi)管接緊，將內(nèi)管前端再插入2號孔液體中壓緊活塞后彈開待管內(nèi)壓力平衡后按下述步驟裝胚胎：空氣5-7mm、胚胎及移植液7-10mm、空氣2-3mm、移植液2mm。注意整個操作過程應遵守無菌操作原則防止移植管內(nèi)管前端5cm、巴士德管前端10cm、毛細巴士德管1cm接觸非無菌區(qū)。5、移植：實驗室工作人員將已裝好胚胎的移植管內(nèi)管送交臨床人員并遞送到術者手中，術者應迅速將內(nèi)管插入到外管中直至內(nèi)外管前端平齊，在助手腹部超聲的引導下將內(nèi)管前端插入到距宮底0.3cm處，當內(nèi)管到達指定位置后保持內(nèi)管位置不變將外管后退雙手緊壓注射器活塞將胚胎注入宮腔，立即將內(nèi)外管取出送實驗室檢查有無胚胎殘留。注入胚胎時及退管后應注意觀察氣泡在宮腔內(nèi)的位置。6、檢查移植管：實驗室人員將胚胎移植管內(nèi)管尖端放置在2號孔液面上，用力壓注射器活塞將管內(nèi)空氣排出，然后將尖端插入移植液中來回抽拉注射器活塞并在顯微鏡下觀察有無胚胎流出，同時注意粘液量的多少和血液污染。保持內(nèi)管尖端在2號孔中將注射器從移植管上取下，注射器活塞上拉，再次將注射器接在內(nèi)管上，緩慢下推注射器活塞將內(nèi)管中的液體全部排入到2號孔中，同時在顯微鏡下觀察有無胚胎殘留。若有胚胎殘留應通知臨床醫(yī)生立即再次移植，再次移植時更換新的胚胎移植管。7、臨床醫(yī)生和實驗室人員按照胚胎移植記錄單的內(nèi)容逐項填寫移植過程。三、胚胎移植后處理1、移植后病人即可回家。2、移植后囑患者保持正常的工作和生活狀態(tài)，不必臥床休息。按照移植前醫(yī)囑用藥。3、囑病人移植后14天做尿妊娠試驗，若陰性，可過三日再次復查；若妊娠，繼續(xù)黃體支持，并于二周后復查B超。四、附錄—胚胎分級標準1、原核期胚胎分級標準原核分級僅限于雙原核受精卵根據(jù)：原核的大小、距離、位置；核仁的數(shù)量、大小、分布等進行分類：Z1、Z2、Z3、Z4，由Z1-Z4胚胎質(zhì)量下降。Z1、Z2、Z3具備以下共同特征：兩原核大小相稱、位于中央兩原核靠攏。Z1：雙側(cè)原核中核仁數(shù)在3-7之間，核仁數(shù)相等、大小適中；雙側(cè)原核中核仁在兩原核交界處排列成線Z2：雙側(cè)原核中核仁數(shù)在3-7之間，核仁數(shù)相等、大小適中；雙側(cè)原核中核仁呈散亂分布Z3：雙側(cè)原核中核仁數(shù)不等、分布方式不同、大小不稱Z4：雙側(cè)原核未靠攏、原核大小明顯不等、原核不在卵中央根據(jù)ScottL.HumReprod.15(11)p2394-2403,2000修改2、WIH評分系統(tǒng)細胞分數(shù)=細胞數(shù)評分+碎片評分+對稱評分，分數(shù)越少胚胎質(zhì)量越差。天數(shù)分數(shù)4分3分2分1分0分D2細胞數(shù)4-6212PN碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球?qū)ΨQ稍不對稱很不對稱D3細胞數(shù)8-104-510碎片程度0%<10%10-25%26-49%>50%裂球?qū)ΨQ稍不對稱很不對稱3、胚胎分級(由Ⅰ-Ⅳ胚胎質(zhì)量下降)分級細胞大小細胞形態(tài)胞質(zhì)碎片均勻規(guī)則均勻清晰無顆粒0-5%稍不均稍不規(guī)則可有顆粒10-20%Ⅲ級明顯不均明顯不規(guī)則明顯顆粒21-50%Ⅳ級嚴重不均嚴重不規(guī)則嚴重顆粒>50%4、囊胚評分1)、囊胚(blastocyst)發(fā)育分期1期:earlyblastocyst囊胚腔小于胚胎總體積的1/22期:blastocyst囊胚腔大于胚胎總體積的1/23期:fullblastocyst囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積4期:expandedblastocyst囊胚腔完全充滿胚胎,胚胎總體積變大,透明帶變薄5期:hatchingblastocyst囊胚的一部分從透明帶中逸出6期:hatchedblastocyst囊胚全部從透明帶中逸出2)、內(nèi)細胞團(innercellmass)分級A級:細胞數(shù)目多,排列緊密B級:細胞數(shù)目少,排列松散C級:細胞數(shù)目很少三.滋養(yǎng)層細胞(trophectoderm)分級A級:滋養(yǎng)細胞層由較多的細胞組成,結構致密B級:滋養(yǎng)細胞層由不多的細胞組成,結構松散C級:滋養(yǎng)細胞層由稀稀疏疏的細胞組成3)、碎片分型Ⅰ型:少量碎片,且與某一細胞相連Ⅱ型:碎片局限于某一部位,主要位于卵周間隙Ⅲ型:小而分散的碎片,位于分裂腔或卵周Ⅳ型:大顆粒碎片,有的形似細胞,常隨機分布并與大小不均的細胞相連Ⅴ型:碎片象壞死性的,伴有完整細胞的特征性的顆粒與胞漿收縮第三節(jié)、驗孕和孕期監(jiān)測移植后14天查血看是否懷孕。若懷孕，維持原來用藥不變，14天超聲檢查，特別注意孕囊數(shù)、孕囊位置、是否有宮內(nèi)外混合妊娠、是否有單卵雙胎。若有疑問，3-7天復查。若宮內(nèi)妊娠診斷無疑問，維持原來用藥一個月再作超聲檢查。第二次超聲檢查如果正常，停止黃體支持。

第三章宮腔內(nèi)人工授精技術操作規(guī)范將精液經(jīng)過處理去精漿后將精子送入女方子宮中，稱為宮腔內(nèi)人工授精(IUI)，分為夫精人工授精(AIH)和供精人工授精(AID)，前者使用的是女方丈夫的精子，而后者使用的精子由供精者提供，不是其丈夫。AIH一般使用新鮮精液，而AID使用的是冷凍精液。第一節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的必備條件宮腔內(nèi)人工授精要求女方至少有一根輸卵管完全暢通，且無影響輸卵管拾卵功能的卵巢—輸卵管粘連，同時要求精液中至少有1000萬條前向運動的精子，前向運動精子總數(shù)不足1000萬條應做體外受精或卵細胞漿精子注射。輸卵管通暢性的檢查方法詳見本科的“超聲輸卵管盆腔顯影術操作常規(guī)”。第二節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的適應癥1．夫精宮腔內(nèi)人工授精主要對象為：輕度的少弱精癥經(jīng)治療無效(至少有1000萬條前向運動精子)不明原因的不孕癥單純排卵障礙經(jīng)促排卵治療半年未孕免疫性不孕癥宮頸因素的不孕癥性交障礙(逆行射精、不射精、陽痿)盆腔粘連行輸卵管卵巢粘連分離術，術后證實盆腔無粘連且輸卵管通暢但經(jīng)半年不孕第三節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精的禁忌癥人工授精的先決條件是至少有一側(cè)輸卵管正常且有適當數(shù)量的精子，因此下列患者不適宜做宮腔內(nèi)人工授精：1.卵巢早衰2.不能耐受妊娠負擔3.嚴重輸卵管損害4.嚴重盆腔粘連5.嚴重子宮內(nèi)膜損害6.雙側(cè)輸卵管阻塞7.夫精人工授精者丈夫精液中前向運動精子數(shù)低于1000萬條者人工授精妊娠的可能性很小，應改做體外受精或卵細胞漿內(nèi)精子注射8.男女急性生殖道感染未治愈者9.不能耐受妊娠負擔或患有不適宜妊娠的疾病10.不符合計劃生育政策者第四節(jié)、宮腔內(nèi)人工授精促排卵常規(guī)宮腔內(nèi)人工授精可以在自然周期、促排卵周期進行，為防止多胎和OHSS應強調(diào)輕微刺激。有證據(jù)表明不明原因的不孕癥患者在促排卵周期的妊娠率高于自然周期一、自然周期人工授精排卵正常的婦女可以在自然周期人工授精，根據(jù)月經(jīng)周期長短，自月經(jīng)周期第10-12天開始監(jiān)測尿LH(參考冷凍胚胎移植內(nèi)膜準備-自然周期章節(jié))，尿LH陽性來院查性激素和超聲檢查、白帶檢查，根據(jù)激素檢查結果，預測排卵時間，如果預測排卵時間在第二天上午前，應在當天下午做AIH(參見自然周期緊急取卵章節(jié))，如果預測的排卵時間在第二天，應該在第二天上午行AIH。AIH不需要嚴格的時間，排卵前或排卵后都可以。一次AIH即可。鼓勵AIH患者保持正常的性生活，特別是臨近排卵期性生活更加重要。二、微刺激促排卵月經(jīng)周期正常的婦女，特別是不明原因的不孕癥患者，采用微刺激可以獲得更高的妊娠率。一般采用來曲唑-HMG重疊方案做輕微刺激當主導卵泡平均經(jīng)線到達18-22mm，內(nèi)膜超過8mm，雌激素超過150pg/ml,如果無自發(fā)LH峰，注射曲普瑞林誘發(fā)排卵。35-37小時AIH。AIH一般不需要做黃體支持，一次AIH即可。LLetrozole2.5mgCycledayAIH三、來曲唑微刺激排卵障礙的患者，采用來曲唑—HMG序貫方案，參考冷凍胚胎移植內(nèi)膜準備-來曲唑微刺激章節(jié)。四、驗孕和孕期監(jiān)測AIH通常在術后第17天驗孕，孕期注意事項和監(jiān)測參見第一篇第五章第三節(jié)(Page71)。

第二篇輔助生殖實驗室技術操作規(guī)范第一章.精液檢查及精子制備第一節(jié)、精液常規(guī)檢查操作方法實驗者收到取精杯后應首先核對取精杯上姓名、編號是否與精液送檢單符合，同時核對精液送檢單上是否漏填重要信息，確認無誤后方可接收。操作技術將在原按WHO第四版實驗指導手冊的基礎上過渡，逐步以WHO第五版實驗指導手冊(WHOlaboratorymanualfortheExaminationandProcessingofhumansemen，fifthedition)所規(guī)定的方法實施精液常規(guī)檢查，并以其規(guī)定格式出檢驗報告。同一份精液標本若有多個檢查項目，按各項目要求分別做標本處理和檢驗。(一)初步檢驗：1．液化后精液檢查前應認真記錄：精液檢查通知單所提供的全部信息2．觀察記錄：精液量、顏色、粘稠度、Ph值及液化時間3．取液化精液10微升滴于潔凈載玻片上，用蓋玻片覆蓋后靜止片刻4．置生物顯微鏡下觀察精液大致狀況并記錄鏡下所見：圓細胞數(shù)(生殖道上皮細胞、生精細胞及白細胞)、紅細胞數(shù)和凝集團塊等，并以個/HP表示。(二)操作方法：1．取液化后精液10微升，滴于MACRO計數(shù)板中央計數(shù)池內(nèi)，加蓋；2．置生物顯微鏡下觀察精子濃度及活力。具體方法如下：分別計數(shù)10個小格內(nèi)前向精子(PR)、非前向精子(NP)及不動精子(IM)的數(shù)目，PR+NP+IM之和即為精子密度(×106/ml)，精子活力分別以PR精子、PR+NP精子占總精子數(shù)的百分比表示，計算方法為：PR/(PR+NP+IM)×100%，(PR+NP)/(PR+NP+IM)×100%。附精子活力分級標準：PR：前向運動精子，不考慮速度NP：各種形式的非前向運動精子IM：不動精子(三)檢驗后處理1．以清水沖洗MACRO計數(shù)板并用酒精棉簽擦拭；2．以酒精紗布擦拭顯微鏡臺面及實驗臺面；3．一次性實驗物品丟棄于指定地點；4．剩余標本按規(guī)定進行污物處理第二節(jié)、精子形態(tài)分析操作方法1．取液化后精液20微升，滴于載玻片一端(上方約1/3處)；2．用另一張載玻片置于滴有精液處與其形成30度角，均勻拉開液滴(詳見WHO實驗手冊)，室溫干燥；3．將干燥后的載玻片置于95%酒精中固定15分鐘，取出室溫干燥后行巴氏染色；4．100倍油鏡下行精子形態(tài)學分析，計數(shù)100~200條精子。結果描述：參閱WHO實驗手冊正常形態(tài)率%異常形態(tài)率%(分別記錄：頭、體、尾及混合畸形率)第三節(jié)、精子低滲腫脹試驗(HOS)(一)配制低滲腫脹液溶0.735g枸椽酸鈉Na3C6H5O7·2H2O和1.351g果糖于100ml蒸餾水中。將該溶液分裝于-20度凍存。用前解凍并充分混勻。(二)實驗方法1．取1ml腫脹液于一只加蓋的Eppendorf管中，37度溫熱約5分鐘。加入0.1mL液化精液，并用吸管輕輕吹打混勻。2．在37度下至少保持30分鐘(注意：不要超過120分鐘)，相差顯微鏡下觀察精子細胞。3．計數(shù)200條精子，計算發(fā)生腫脹的精子所占百分比。精子尾部形狀發(fā)生變化的定義為精子腫脹。(三)結果描述腫脹精子所占百分比可以代表存活精子的比例。(四)注意事項1．某些精液標本在置于HOS溶液前即有尾部卷曲的精子，因此要在放置于HOS溶液前觀察射出精液。處理后獲得的尾部卷曲精子的百分比減去未處理標本中尾部卷曲精子的百分比，即可以得到HOS試驗中出現(xiàn)反應的精子的實際百分比。2．在臨床使用前，應當用老批號的HOS溶液對新批號的HOS溶液進行校驗，二者不應有顯著性差異(配對t檢驗P＞0.05)。如果差異顯著應廢棄該批試劑，重新配制。全自動精子分析系統(tǒng)使用說明(西班牙SCA全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng))全自動精子分析系統(tǒng)可自動探測精子運動軌跡，按WHO實驗手冊內(nèi)CASA各項參數(shù)指標，計數(shù)精子活率、活力、密度、直線運動速率等。系統(tǒng)由電腦軟件和顯微鏡兩部分組成。操作方法如下：(一)初步檢驗：參見精液常規(guī)檢查操作方法相關部分。(二)自動分析：1．開啟電腦→CASA分析軟件→建立新檔案(鍵入患者信息)→保存2．取液化精液10微升滴于精子計數(shù)板中央計數(shù)池內(nèi)，加蓋玻片→置相差顯微鏡下(10×)調(diào)節(jié)視野至圖像清晰3．點擊密度活動力分析→進入分析界面→分析→保存結果(如果需要，可以做人工校正)→報告單(預覽或打印)→退出分析系統(tǒng)4．報告部分內(nèi)容記錄于《精液分析登記本》上，年終存檔保留。(三)分析后處理：參見精液常規(guī)檢查操作方法相關部分。第五節(jié)、抗精子抗體(MAR)檢測方法(一)原理：本試驗以人IgG敏化綿羊紅細胞，用人IgG制備羊抗人IgG血清，采用MAR法檢測標本中IgG類抗精子抗體。試劑由A液、B液和C液組成。(二)步驟：1．取液化精液10微升滴于載玻片上，加入A液10微升混勻，放置15秒；2．加入B液10微升混勻，覆以蓋玻片。分別在3分鐘和10分鐘后于生物顯微鏡(40×)或相差鏡下鏡檢，觀察運動精子表面是否黏附有敏化的紅細胞(sRBC)。(三)結果判定：1．精子表面無AsAb，可見精子在粘附的sRBC間自由泳動，敏化sRBC間的凝集說明試劑可靠。2．精子表面有AsAb存在，則敏化sRBC粘附于精子上并一同扭動。在強陽性情況下，凝集塊極為巨大，精子只在敏化sRBC形成的凝塊中扭動。3．至少計數(shù)100條活動精子，計算粘附有sRBC的活動精子在總活動精子中所占的百分比。4．陽性率R=(粘附sRBC的活動精子數(shù)/計數(shù)總活動精子數(shù))×100%R≤10%，判定為陰性；R＞10%，陽性；R≥40%，判定為強陽性。(四)注意事項：1．試劑需室溫平衡后使用；2．A液使用前應充分混勻；3．液化不良精液可用C液洗滌后檢測；4．標本中活動精子密度高時，應適當增加活動精子計數(shù)的數(shù)目。第六節(jié)、細針附睪/睪丸穿刺取精術及精子制備常規(guī)(一)操作步驟：1．準備10ml和5ml及1ml注射器各1支，2%利多卡因5-10ml。將5ml2%利多卡因注射在陰囊部精索內(nèi)，封閉精索神經(jīng)。2．術者用左手固定附睪，選擇無血管區(qū)以1ml注射器在睪丸表面及陰囊皮膚內(nèi)注入0.5ml2%利多卡因作局部麻醉后，以10ml注射器直接經(jīng)皮刺入附睪或睪丸后，邊持續(xù)負壓抽吸邊退出，利用負壓抽出附睪內(nèi)精子或睪丸內(nèi)曲細精管，取下放入含培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中間凹內(nèi)，立即轉(zhuǎn)交實驗室處理。3．壓迫穿刺點至無出血，墊一塊紗布于內(nèi)褲里，患者即可下床行走，囑其2小時不做劇烈運動。(二)實驗室處理：1．將培養(yǎng)皿內(nèi)的曲細精管用兩支1ml注射針挑動，翻轉(zhuǎn)洗滌1~2次；2．將曲細精管疊加切割(撕碎)，使精子及其組織細胞游離于培養(yǎng)液中；3．用于臨床診斷可立即鏡檢(20×)觀察有無精子，活動否，通知臨床醫(yī)生；4．用于臨床治療(ICSI)，混懸液吸入離心管中，靜置培養(yǎng)箱孵育30-60分鐘，直到用前反復吹打混勻，再靜置數(shù)分鐘，待大塊組織沉淀后將上層液體離心(1500轉(zhuǎn),10分鐘)后使用。第七節(jié)、伊紅試驗(一)準備試劑用9g/L氯化鈉水溶液配制5g/L的伊紅Y溶液。(二)試驗方法1．將一滴新鮮精液與一滴伊紅溶液在載玻片上混勻，并覆以蓋玻片。30秒后在400倍光學顯微鏡下觀察。2．計數(shù)200條精子，并區(qū)分活精子與死精子?；罹硬恢?白色)，死精子被染成紅色。(三)結果描述計數(shù)條活精子數(shù)條(%)死精子數(shù)條(%)第二章.宮腔內(nèi)人工授精的實驗室處理第一節(jié)、取精取精前一般禁欲5-7天，過長或過短的禁欲時間均有礙精子的質(zhì)量，但對于精液差的病例可適當延長禁欲時間。取精時間安排在IUI前1-2個小時，取精在專用取精室中進行，室內(nèi)配有雙人床或三人沙發(fā)，每日紫外線消毒、擦臺面。病人在取精過程中須保持取精室周圍環(huán)境安靜，以免造成精神緊張引起取精困難。若發(fā)生取精困難可以性交方式取精；有些男性不習慣醫(yī)院環(huán)境可在家取精并在半小時之內(nèi)將精液送至醫(yī)院，運送過程中應注意精液保溫。取精前患者丈夫先排尿沖洗下尿道，清洗雙手，將已寫上姓名及病史號的取精杯交患者丈夫并做如下交待：取精杯已消毒，勿污染杯內(nèi)壁，精液射入取精杯后應立即將杯蓋旋緊盡快送實驗室處理。實驗室收到取精杯后應記錄收到時間、核對姓名。逆行射精的取精方法：逆行射精主要表現(xiàn)為患者性交過程中有射精感，但沒有精液射出。若膀胱頸在將要射精時未能關閉，射出的精子可能會逆行進入膀胱中，性交后在尿液中發(fā)現(xiàn)精子則可確診。對于逆行射精患者需要特殊處理，取精前口服碳酸氫鈉4克5-7天以堿化尿液，有利于保持尿液中精子的活動力。不可服用咖啡及飲料，可以服茶水，服水的目的是使尿液的滲透壓降低，若有條件測量尿液的滲透壓，在尿液滲透壓達到280-320之間時取精最好，取精前測量尿液的PH值，應在6.8-7.4之間。逆行射精的患者需要特殊的容器來收集精液，手淫前排尿，不必完全排空膀胱，如果手淫中有精液射出應收集于容器中，手淫后立即排尿或?qū)驅(qū)⒛蛞菏占诹硪粋€容器中。尿液樣本必須馬上處理，因為即使在服用了重碳酸鹽之后尿液仍是酸性的，幾乎會立即殺死精子。一旦樣本送到實驗室，馬上測量及記錄尿液的體積及PH值。尿液樣本必須要充分混勻，因為死精子會下沉到容器的底部。所有的精子，即使是不動的精子，都需要計數(shù)。將一滴尿液樣本滴在載玻片上進行計數(shù)，如果精液數(shù)量足夠多，還應滴一滴精液樣本在Maker板上進行分析。對濃縮后的尿液及可能獲得的精液，采用密度梯度離心處理，尿液樣本以1500g離心10min。然后用新鮮的培養(yǎng)液重新懸浮沉淀。離心時，正常射出的精液(如果有的話)也應進行分析。從尿液中取得的沉淀也應該在載玻片上或者Maker板上分析其密度、活力以及形態(tài)。第二節(jié)、精液處理1.試劑：1)精子洗滌培養(yǎng)基：用于精液洗滌和培養(yǎng)的試劑很多，但有二點是共同的，第一，均含有人體蛋白，如白蛋白或血清；第二，均含有葡萄糖。這兩個成分是精子體外獲能所必需的。用于精液洗滌的培養(yǎng)基按其所含的緩沖劑不同分為兩大類，一類是以碳酸氫鈉做為緩沖劑，需在5%的二氧化碳氣體中保持pH值在7.4左右，但在空氣中很快變堿；另一類培養(yǎng)基含有低濃度碳酸氫鈉及高濃度的HEPES，這類試劑在空氣中pH變化很緩慢，可長時間保持pH在7.4左右，但在5%二氧化碳環(huán)境中pH值變酸。以上兩類培養(yǎng)基均可用于精子洗滌，但有研究表明用含HEPES的培養(yǎng)基處理精子能更好地保護精子的功能，IUI妊娠率更高。目前精子洗滌培養(yǎng)基已商品化，有些出廠時已添加人體白蛋白(HSA)，有些需自己添加蛋白或血清。培養(yǎng)基可以是簡單的平衡鹽溶液如人輸卵管液(HTF)、Earle‘s液(EBSS)、Tyrode’s液(T6)等，有些精子培養(yǎng)基配方很復雜，如Ham‘sF10。2)梯度離心試劑：目前用于梯度離心試劑很多，本中心使用的Isolate在出廠時滲透壓、pH值及梯度已調(diào)好并做過嚴格的生殖毒性檢測，用前只需預溫，現(xiàn)開現(xiàn)用。2.儀器及耗材1)儀器：離心機(水平式)、干熱培養(yǎng)箱、恒溫試管架、電動加樣器、超凈工作臺、冰箱、試管架、顯微鏡、精子計數(shù)板。2)耗材：15ml尖底離心管、14ml圓底離心管、10ml刻度量管、9英寸無菌巴士德管、人工授精管(Tomcat)、1mlB-D注射器、5ml全塑料B-D注射器、酒精燈、硅膠接頭、載玻片、蓋玻片。3)精液冷凍保存設備及試劑、耗材：液氮、液氮罐、精液冷凍試劑、冷凍管等。3.處理前準備1)取精前臨床工作人員應通知實驗室有關人員預溫處理精液所需的試劑及試管，打開超凈工作臺并準備儀器。2)精液取出后應盡快放35-37C恒溫培養(yǎng)箱中保溫，每5-10分鐘搖動幾下促使精液液化。3)正常精液在30分鐘內(nèi)液化，若超過30分鐘仍不液化應使用帶針頭的全塑料注射器反復抽吸精液直至精液液化。4)若精液中瓊脂樣顆粒多應將精液倒入試管中垂直靜置一定時間待瓊脂樣顆粒沉入管底后吸取上層液體處理。5)精漿中含有受精抑制成分，應盡早將精子從精漿中分離，精液一旦液化應盡快處理，處理前取少許精液做常規(guī)檢查測量精子濃度、成活率及運動率，并根據(jù)檢查結果選擇處理方式。6)實驗室工作人員在收到精液杯后應仔細核對杯上的姓名和病史號，凡接觸精液的各種試管、巴士德管均需清楚標記，接觸過病人體液的試劑不得再用于其他病人。精液中可能含有致病微生物，處理時工作人員應戴一次性手套、口罩、帽子，處理精液后用75%的酒精或10%雙氧水擦洗臺面，超凈工臺應定期消毒和細菌培養(yǎng)。4.精液處理方法1)調(diào)恒溫箱：溫度設定為35度2)試劑:Isolate、SSS、HTF-Hepes3)處理步驟：精液取出后置恒溫箱液化,同時將試劑及試管放恒溫臺預熱待精液液化后取少量精液計數(shù)，如果前向運動精子總量少于二百萬不可用梯度離心，應使用離心洗滌法。取一支15毫升尖底離心管，先加1毫升IsolateUP，后加1毫升IsolateDOWN,再加精液，200g離心20分鐘去上清,沉淀+1ml5%sssHTF-Hepes(不能碰壁)混勻200g離心5分鐘(或100g離心10分鐘)重復洗滌兩次去上清,沉淀加0.3-0.5ml5%SSSHTF-Hepes混勻取少量精子懸液計數(shù)B．上游法適應癥基本同上，但是精液粘度高或不液化則不適宜用上游法，一般上游法的回收效率比非連續(xù)梯度離心要低。1)方法一：精子經(jīng)兩次洗滌后，棄上清，沉淀留管底，小心沿管壁加入5%SSSHTF-HEPES1ml傾斜45度置37度恒溫箱45分鐘，2)方法二：將精液標本置試管底部，小心沿管壁加入含5%SSSHTF-HEPES1.5ml傾斜45度置37度培養(yǎng)箱孵育45分鐘，收集云霧狀上層培養(yǎng)液，經(jīng)兩次洗滌后沉淀用0.5ml洗精液懸浮做授精用。C．兩次洗滌法適用于前向運動精子總數(shù)低于200萬的病人，冷凍精液人工授精一般也用兩次洗滌法。一份精液加一份洗精液稀釋，200g離心5分鐘，沉淀加1ml洗精液懸浮，離心洗滌兩次后沉淀加0.3-0.4ml洗精液懸浮做授精用。第三節(jié)、授精人工授精前陰道超聲掃描看有無排卵。人工授精不需陰道消毒，但用無菌生理鹽水紗布擦洗陰道和頸管。將TOMCAT管預先做適當?shù)膹澢?，接?mlB.D.注射器,并將注射器活塞推到底,核對精子無誤后將精子懸液吸入到授精管和注射器中。將授精管宮頸管輕輕插入到宮腔中，緩緩將精子懸液注入宮腔，輕輕退出授精管和窺陰器。授精后患者平臥一刻鐘。離院前向病人交代若有惡心、嘔吐、腹痛、嚴重腹脹、體重明顯增加等卵巢過度刺激癥狀應立即復診。第四節(jié)、文件書寫IUI前簽定“夫精宮腔內(nèi)人工授精知情同意書”。按“不孕癥檢查常規(guī)”書寫病歷及作輔助檢查，促排卵或超排卵過程記錄在“治療單二”中，精液處理和授精過程記錄在“宮腔內(nèi)人工授精記錄單”中。若妊娠將妊娠過程記錄在“妊娠結局記錄單”中。第三章.體外受精-胚胎移植常規(guī)第一節(jié)、儀器準備(最遲提前2天)胚胎實驗室風機、空調(diào)24小時不間斷運行，室溫控制在24度(±2度左右)。取卵手術室、ET室使用結束后關閉風機和空調(diào)，用前半小時打開。CO2培養(yǎng)箱:每日開箱前觀測箱溫(水銀精密溫度計)每周一次使用CO2測定儀監(jiān)測培養(yǎng)箱的CO2濃度，記錄并同時記錄箱溫每周換水擦洗一次，并作記錄胚胎操作箱:每日觀測箱溫，并作記錄每周一次使用CO2測定儀監(jiān)測操作箱的CO2濃度，記錄并同時記錄箱溫對異常變動要先報告實驗室負責人，再由負責人根據(jù)觀測情況進行調(diào)動，并在24小時內(nèi)觀測其是否恢復正常每日加水，每周一下班前清潔一次。第二節(jié)、試劑1.HTF和U-IVF:分裝于大、小試管，(HTF分裝10ml/大試管用于揀卵預培，U-IVF分裝1ml/小試管用于處理后精子培養(yǎng)用預培)，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡。用途:大試管液體用于洗卵,配授精盤(一般井皿每孔裝卵不超過8個,根據(jù)卵的多少配1-2個盤)；小試管液體用于精子培養(yǎng)。2.ECM+10%SSS:9mlECM+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡用途:用于制備分裂期胚胎培養(yǎng)皿。3.MB+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡用途：制備囊胚期胚胎培養(yǎng)皿。4.如果用CSC培養(yǎng)基，則不需2.和3.培養(yǎng)基：CSC+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡。用途：制備從受精卵至囊胚期的胚胎培養(yǎng)皿。5．沖針液:flushingmedium至少提前1天37℃預溫用途:用于沖洗卵泡。6．Isolate:用途:處理精液，用前配制，先批量分裝1mlLow液于多個尖底離心管，再在各Low面上輕輕加上Up液1ml備用。7．HTF-HEPES+10%SSS：9mlHTF-HEPES+1mlSSS，分裝于2個試管中(5ml/試管)，密閉，放4度冰箱備用。用途：用于精子洗滌，ICSI皿配盤。用量：每個病人5ml。第三節(jié)、所需物品巴斯德管,直徑為100mm的大平皿,35mm的小平皿，井皿,大試管,小試管,1ml注射器,吸頭,各種接頭,刻度離心管,毛細巴斯德管,試管架,煤氣噴燈,鑷子,電動加樣器,紗布,取精杯，精液點樣濾紙等第四節(jié)、步驟1.提前一天：配制洗卵授精液、胚胎培養(yǎng)液、精子洗滌液等試劑,并將洗卵授精液、胚胎培養(yǎng)液置CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜，精子洗滌液密閉置4度冰箱保存，沖針液置37℃預溫。授精盤配置方法：在超凈臺下按無菌操作要求將授精液(HTF)2ml加入井皿外圍，將HTF1.0ml加入井皿中央，外圍用于洗卵，中央用于授精。注意：受精盤的底座與蓋均應用記號筆注明病人姓名及ART號。2.Day0:取卵當天:(即注射HCG后36h)(1).開通二氧化碳氣體，待氣體濃度顯示穩(wěn)定后可測定培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度，并檢查胚胎操作箱溫度，作相應校正。(2).根據(jù)當天取卵例數(shù)，預溫相應井皿、大平皿，并準備相應量紗布、1ml注射器。(3).取卵前準備一支巴斯德管,，從培養(yǎng)箱取出洗卵液,將洗卵液放置于已預溫的井皿中配制洗卵盤，井皿外圍加液2ml，中央加液1ml。找卵過程中將找出的卵放于井皿外圍進行清洗，應注意將血細胞清洗干凈，必要時用1ml注射器切除污染的血塊、血斑及黃素化的顆粒細胞，撿卵結束時將已清洗干凈的卵冠丘復合體成批放于井皿中央培養(yǎng)。(4).取卵結束后丈夫取精，精液(精液杯已標明病人姓名)置35℃恒溫箱液化，液化后盡快處理精液。若精液取出半小時后仍不液化，使用2ml全塑料注射器反復抽吸精液促使液化。取精前開始預溫Isolate、精子洗滌液、2支15ml尖底離心管(室溫)。精液處理方法：準備兩支巴斯德管(標明病人姓名),涂片鏡檢精液情況,根據(jù)精子的密度和活力適用不同每層厚度的梯度離心方法(如0.3ml,0.5ml,1ml，一般用1ml)。取一支如前批量準備的Isolate液管,標注病人信息，加入2ml精液(.加入精液量依精子濃度、活力而定，一般為2ml。若精液差，可采用多管離心，每管加精液1-2ml)。200g離心15分鐘后仔細去上清,留沉淀,換管將沉淀移入到干凈預溫的梯度離心管中，加1mlHTF-HEPES洗滌精液，輕輕搖勻,200g離心5分鐘,或者100g離心10分鐘,洗滌2次后去上清,加入適量精子培養(yǎng)液(分裝于小試管的1mlU-IVF)，取少許精子懸混液計數(shù)精子濃度，根據(jù)計數(shù)結果將精子濃度調(diào)整到300萬/ml-1000萬/ml，將處理好的精子置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少半小時方可授精。(5).取卵后4-6小時,將授精盤取出,每個井皿中央加精子30萬條，混勻，立體顯微鏡下再次觀察精子密度待確定密度合適時置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。授精時間應根據(jù)卵的成熟度決定，若卵很成熟應在取卵后4小時授精；若卵中度成熟在取卵后5小時授精；若卵成熟度差應延遲到8小時后授精。(6).配制生長液滴皿,(皿的底座與蓋均應標明病人姓名，皿蓋要標ART號)CO2培養(yǎng)箱平衡過夜3.Day1:(1).去除顆粒細胞,即拆蛋,將受精卵移入已預溫平衡的CSC胚胎培養(yǎng)皿中,1個/液滴,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(2).于倒置顯微鏡下觀察受精情況4.Day2Day3:胚胎觀察并冷凍/移植(1).觀察胚胎，并做好記錄。(2).挑選優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍或者移植,非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚培養(yǎng)(3).裝胚胎(詳見胚胎移植常規(guī)):將注射器與移植管旋緊,即可裝胚胎,順序為:10mm液體→3-5mm空氣→胚胎+液體10mm→3-5mm空氣→2mm液體5.囊胚培養(yǎng)：(如果是連續(xù)培養(yǎng)基CSC培養(yǎng)，則可省略該兩次配盤及轉(zhuǎn)盤操作)(1)．Day2下午及Day4下午配置MB囊胚培養(yǎng)液滴皿，(皿的底座與蓋均應標明病人姓名)CO2培養(yǎng)箱平衡過夜。(2)．Day3下午將需要囊胚培養(yǎng)的胚胎移至囊胚培養(yǎng)液中，觀察并做好記錄。(3)．Day5上午觀察胚胎并做好記錄。(4)．Day5下午冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚，未成囊胚胎轉(zhuǎn)移至新的囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)。第四章.卵細胞漿內(nèi)單精子注射常規(guī)卵細胞漿內(nèi)單精子注射技術(IntrocytoplasmicSpermInjection，ICSI)是治療嚴重男性因素不孕患者的最有效治療方法，在輔助生殖技術中占有重要地位。ICSI的操作方法在各實驗室雖有細微差異，但目前尚無足夠的資料證明各實驗室實驗過程及操作方法上的區(qū)別會對妊娠結果有影響。本文將重點介紹本中心進行ICSI的實驗程序。第一節(jié)、儀器配置及注射前準備(一)儀器配置1．進行ICSI操作時應使用高分辨率的倒置顯微鏡，目前有多種品牌的高檔倒置顯微鏡能滿足ICSI的操作要求，但選購時應考慮以下幾個方面：1)必須配置Hofman或微分干涉(DIC或Nomarski)光學系統(tǒng)。目前國內(nèi)外大多數(shù)實驗室使用的是Hofman光學系統(tǒng)，雖然微分干涉光學系統(tǒng)的分辨率比Hofman分辨率高，但微分干涉系統(tǒng)必須使用玻璃培養(yǎng)皿且價格昂貴，因而較少使用。2)配4倍，10倍，20倍物鏡，方便操作。3)使用萬能載物臺4)安裝恒溫加熱裝置，如恒溫加熱板或恒溫加熱箱2．顯微操作儀顯微操作儀的作用是將大幅度的動作轉(zhuǎn)換為微細的動作，其質(zhì)量的好壞會直接影響操作的方便性。目前國內(nèi)外使用最多的是日本Narishige公司生產(chǎn)的液壓顯微操作儀，這種顯微操作儀由粗動定位及精細操作兩部分儀器構成，前者為機械式或電動控制，其工作距離大，但不精密。后者為液壓控制，其工作距離小，精密度在一定范圍內(nèi)可調(diào)，能進行X、Y、Z三個方向運動，并有萬向搖柄能在水平面任意方向運動，萬向搖柄有直立式及懸吊式兩種可根據(jù)個人習慣選擇。顯微操作儀應與所配的倒置顯微鏡匹配，如果顯微鏡使用恒溫加熱箱，恒溫箱必須與顯微操作儀匹配。3．顯微注射儀進行卵細胞漿內(nèi)單精子注射時用顯微注射儀控制注射針 (microinjectionneedle)及持卵針(holdingpipette)內(nèi)的液體運動，因此顯微注射儀的好壞決定ICSI的成敗。國內(nèi)外大多數(shù)單位使用微米注射儀進行顯微注射。4．攝錄像裝置配備450線以上的攝像頭和監(jiān)視器，配備高清晰度像機。5．防震平臺高頻震動會使顯像模糊，增加注射難度，如果所在實驗室有震源干擾，應使用氣墊臺進行防震。本中心進行卵細胞漿內(nèi)單精子注射的儀器配置如下：OlympusIX71倒置顯微鏡配4倍明視野物鏡，20倍及40倍Hofman物鏡NikonTE300倒置顯微鏡配4倍明視野物鏡，10倍及20倍Hofman物鏡OlympusIX-IBM恒溫箱及恒溫加熱控制儀NarishigeMMN-1機械式顯微控制儀兩個進行粗動定位NarishigeMMO-202N油壓操作儀兩個進行微細操作UT-2關節(jié)兩個HT-7持針管兩個HamiltonGastight螺旋注射器一支控制持卵針內(nèi)的液體運動JVCTK-C1381攝像頭JVCBM-H1400PN監(jiān)視器(二)顯微注射針進行ICSI時使用兩種顯微注射針：即持卵針及顯微注射針。顯微注射針由外徑1毫米、內(nèi)徑0.78毫米的硼硅玻璃毛細管拉制而成，管尖內(nèi)徑5微米，外徑7微米。管末端平面與毛細管縱軸呈30-45度的夾角，并拉成小刺(spike)，管末端約1毫米長的毛細管與管體折成一定夾角，一般為35度。持卵針也由外徑1毫米，內(nèi)徑0.78毫米的硼硅玻璃毛細管拉成，管尖外徑70-120微米,管尖開口15-30微米，管末端平面與毛細管縱軸垂直，管末端約1毫米長的毛細管與管體折成一定夾角，一般為35度。目前商品化的顯微注射針有多種品牌，相互之間有一定的細微差別，本中心使用的是HUMAGEN生產(chǎn)的35度夾角的顯微注射針。(三)儀器安裝及調(diào)試新購買的倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)在安裝完畢后需進行反復的調(diào)試，包括Hoffman系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、恒溫裝置的調(diào)節(jié)及顯微操作儀的調(diào)節(jié)。對顯微操作儀進行調(diào)節(jié)的目的是使其X、Y、Z各向運動達到最大，持針管和顯微鏡載物臺的夾角應和所選購的顯微注射針的夾角一致，以使安裝后的顯微注射針的前端毛細管基本與水平面平行。第二節(jié)、卵細胞漿內(nèi)精子注射的適應癥ICSI是治療嚴重少、弱精癥的有效手段，凡經(jīng)IVF治療受精率低于50%的病例均是ICSI的適應癥。近年來由于ICSI技術的改進及對ICSI操作本身安全性的肯定使ICSI的適應癥已逐漸擴大。對于無前次IVF受精率的資料作參考的病例在考慮是否進行ICSI前應行精子回收實驗，若回收實驗達到IVF的標準則不考慮ICSI，若回收實驗仍不能決定是否進行IVF或ICSI，則一部分卵子行IVF，一部分卵子行ICSI。1．精液中正常形態(tài)精子超過10%且回收活動精子超過50萬條可進行常規(guī)IVF，若受精率低于50%在下一個周期做ICSI。2．精液中正常形態(tài)精子不超過10%但回收活動精子超過50萬條則部分卵作IVF部分卵作ICSI，如果IVF受精率超過50%在下一個周期作IVF。3．回收活動精子低于50萬條或精液中偶見精子行ICSI。4．睪丸或附睪取精病例作ICSI。5．免疫珠實驗超過50%的精子頭結合IgA抗體則行IVF加ICSI。6．前次IVF受精率低于50%行ICSI。7．不明原因不孕癥經(jīng)超排卵加宮腔內(nèi)人工授精三個周期未妊娠者行IVF加ICSI。8．卵子質(zhì)量差或胚胎質(zhì)量差均不是ICSI的適應癥。第三節(jié)、ICSI操作程序(一)取卵前日：1．配PVP：1支PVP干粉(Irvinescientific)加1mlHepes緩沖的人輸卵管液(HTF-Hepes，IrvineScientific或InVitrocare)注意不要加蛋白，加液后靜置兩小時以上，待完全溶解后轉(zhuǎn)入小試管中放置于4度冰箱，可使用一個月，使用前37度預溫后即可使用。本中心使用即用型10%PVP溶液(IrvineScientific)。2．配透明質(zhì)酸酶：1瓶透明質(zhì)酸酶(Sigma，H-4272每瓶約30mg)加入30mlU-IVF(UniversalIVFMedium，Origio)配成每毫升800單位濃度，按每管1ml分裝，-20度冷凍可長期保存。解凍后放4度冰箱可使用一月，使用前放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過夜，拆蛋時每1ml拆蛋液加1-2滴800IU/ml透明質(zhì)酸酶即為濃度為20-40IU/ml的工作液。如果拆蛋過程無二氧化碳控制則應使用HTF-Hepes配制透明質(zhì)酸酶，配制濃度及保存方法同上，但使用前不可放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡，臨用前放37度恒溫箱平衡即可使用，使用方法同上，但使用的拆蛋液為含Hepes的HTF。本中心除顯微注射過程外其他胚胎操作過程均在二氧化碳控制下進行，以下描述為本中心進行ICSI操作的具體過程。3．拆蛋液：U-IVF加10%SSS(SerumSubstitutiveSupplement，IrvineScientific)5ml放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過夜。4．注射液：HTF-Hepes加10%SSS5ml分裝在兩個小試管中，分別為3ml、2ml分別作洗精及注射用，用前溫度平衡。5．礦物油：4ml礦物油用前溫度平衡6．其他試劑：取卵液、沖針液等同體外受精7．生長液：ECM或CSC液加10%SSS做生長液，用前配成微滴置二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過夜，顯微注射結束后將注射卵轉(zhuǎn)入其中培養(yǎng)。8．若行睪丸穿刺或活檢取精則需準備HTF-Hepes+10%SSS10ml及U-IVF或HTF+10%SSS2ml(用前平衡6小時以上)(二)取卵當日1.取卵同體外受精。2.精液處理：由于少、弱精癥患者精子體外存活時間短一般精液處理時間選擇在顯微注射前,精液處理完畢后應盡快做顯微注射以免注射前精子死亡，對于嚴重少弱精的病例應特別注意。1)常規(guī)ICSI精液處理：兩次離心洗滌。操作步驟如下：精液充分液化后加入1-2mlHTF-Hepes+10%SSS吹打均勻，1500轉(zhuǎn)離心3-5分鐘，去上清后沉淀加入HTF-Hepes重懸，再次離心洗滌，最后用0.3-0.5mlU-IVF或HTF+10%SSS重懸沉淀(根據(jù)沉淀多少決定加入的液體量)，取少許精子懸混液顯微鏡下觀察精子濃度，培養(yǎng)箱中放置備用。2)附睪精子處理：兩次離心洗滌，步驟同上。3)睪丸穿刺或活檢組織處理：一般在取卵日上午進行經(jīng)皮細針睪丸穿刺抽取睪丸組織，睪丸組織在HTF-Hepes+10%SSS中漂洗去除血細胞后移入1-2ml干凈的HTF-Hepes中，用一次性1ml注射器針頭切碎，懸濁液置倒置顯微鏡下觀察證實有活動精子后，將懸濁液離心洗滌兩次，0.1-0.3mlU-IVF或HTF+10%SSS重懸沉淀(根據(jù)精子數(shù)量多少決定加入的液體量)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱備用。提前進行睪丸穿刺的優(yōu)點是，睪丸組織中未成熟精子經(jīng)過培養(yǎng)，可提高精子的活動力及活動率使顯微注射過程更加順利。經(jīng)細針睪丸穿刺未找到精子的病例仍可進行睪丸切開活檢，有時能獲得足量的活動精子。3．拆蛋：拆蛋的目的是用透明質(zhì)酸酶消化卵冠丘復合體外層的卵丘，然后用機械的方法除掉卵母細胞外的放射冠使卵母細胞暴露。拆蛋的時間為取卵后3-4小時。拆蛋程序：1)準備工作：預溫一塊中心皿，一支巴士德管，兩支毛細玻璃管(一支內(nèi)徑比卵稍細，另一支內(nèi)徑比卵稍粗)。2)配拆蛋盤：操作箱通二氧化碳后取出在二氧化碳培養(yǎng)箱中已平衡的拆蛋液(U-IVF或HTF+10%SSS)及透明質(zhì)酸酶儲備液，分別在中心皿中心和外圍處加拆蛋液1ml，用巴士德管加3滴透明質(zhì)酸酶儲備液于中心孔中，吹打均勻。3)消化卵丘：將卵冠丘復合體放入中心孔中(每次3-5個)用巴士德管反復吹吸約10秒，然后盡快將外周包有放射冠的卵細胞轉(zhuǎn)入中心皿外圍的無透明質(zhì)酸酶的拆蛋液中，等待除去放射冠。因為透明質(zhì)酸酶的長時間作用對卵子可能有潛在的損害，所以卵子與透明質(zhì)酸酶接觸的時間應盡可能的短，洗滌時從上一個孔帶入下一孔的液體應盡可能的少。重復此步驟直至所有的卵冠丘復合體的卵丘被消化。4)除去放射冠：用已拉好的內(nèi)徑稍細的毛細玻璃管吹吸卵放射冠復合體，使放射冠脫離卵母細胞，待所有的卵母細胞放射冠均除去后，用內(nèi)徑稍粗的毛細玻璃管將卵子ECM洗滌液中洗滌3-5次，最后轉(zhuǎn)入ECM培養(yǎng)液滴中，放回二氧化碳培養(yǎng)箱中待用。4．安裝顯微針：將石蠟油注入兩側(cè)顯微注射儀的管道中排盡其中的氣泡。在4倍物鏡下安裝持卵針，調(diào)節(jié)UT-2關節(jié)并旋轉(zhuǎn)持針管使持卵針末端部分處于水平位并與X軸平行。按同樣的方法安裝注射針。兩側(cè)顯微針安裝完畢后將兩針升起，兩針高度應超過注射盤的高度。5．準備顯微注射盤：1)在拆蛋前預溫一個Falcon35mm的培養(yǎng)皿，預溫PVP、注射液及石蠟油。2)由于注射盤液滴很小，為減少液體揮發(fā)，作注射盤時動作應迅速，事先應準備好所需的各種物品及試劑，液滴作好后應迅速加石蠟油完全覆蓋。3)本中心用35mm培養(yǎng)皿蓋作注射盤，液滴形狀、大小及分布如下圖，液滴分布應在直徑25mm的區(qū)域：說明：1-11號液滴為注射液，直徑2-3mm，每滴放卵1-2個12號液滴為PVP13號液滴為注射液，放置精子14號液滴為注射液，用于洗卵，面積約5*10mm2由于注射盤深度約5mm，因此各液滴厚度應低于2mm注射盤作好后，將卵轉(zhuǎn)移到14號液滴中，清洗后將成熟的卵母細胞轉(zhuǎn)移到1-11號液滴中，每滴1-2個卵。自12號液滴右下角將精子懸液緩緩加入其中，加入量視精子濃度而定，但沉淀擴散的范圍不超過液滴轉(zhuǎn)折處。6．準備注射系統(tǒng)1)將作好的注射盤置于倒置顯微鏡載物臺上，下調(diào)注射針及持卵針直至接近石蠟油的表面。2)移動視野至14號液滴，將石蠟油注入持卵針中至管尖，然后將持卵針下降到14號液滴中，吸入約5毫米液體，再將注射針升高到石蠟油表面以上。3)移動視野到PVP液滴，將石蠟油注入到注射針中至管尖,注射針下降到PVP液滴中，吸入少許PVP到注射針內(nèi)，待針內(nèi)壓力平衡后即可開始顯微注射。7．卵細胞漿內(nèi)精子注射1)移動注射針至13號液滴左側(cè)邊緣，將形態(tài)正常的活動精子吸入到注射針內(nèi)，移動注射針至PVP液滴將精子排入其中。2)用注射針針尖壓住精子尾部，將注射針迅速劃過精子尾部使精子制動。精子制動的目的是破壞精子尾部的細胞膜而使其激活卵子，有利于受精。3)將注射針針尖對準已制動精子的尾端緩緩將精子吸入到注射針內(nèi)。每次可吸入1-2條精子，注射1-2枚卵子，2條精子之間的距離一般超過三個精子的長度。4)將注射針移到1-11號液滴中，下降持卵針將待注射的MⅡ期卵母細胞輕輕吸住，用注射針轉(zhuǎn)動卵母細胞將極體放在6點或12點處，然后將卵母細胞吸緊。調(diào)節(jié)顯微鏡焦點對卵母細胞赤道部聚焦，調(diào)節(jié)注射針位置使注射針與卵母細胞赤道部在同一個平面，將注射針輕輕按壓于卵母細胞上證實卵母細胞與注射針在同一個平面后將最前端的一個精子輕輕推至針口然后將注射針刺入卵母細胞內(nèi)，刺入深度約為卵母細胞直徑的三分之二，在精子排出前先回吸胞漿直至胞漿在針管內(nèi)快速流動時立即將精子連同吸出的胞漿注入到卵母細胞內(nèi)，一旦精子頭部進入胞漿即可將注射針輕輕退出到卵母細胞外。回吸胞漿的目的是為了破壞細胞膜保證精子注入到細胞漿內(nèi)。注入精子時流入胞漿內(nèi)的PVP量應盡可能的少。5)將固定在持卵針上的卵母細胞輕輕松開再固定另一個待注射的卵母細胞重復以上步驟直至所有的MII期卵子均被注射。6)注射完畢后將已注射的卵母細胞轉(zhuǎn)移到生長液滴清洗3次后按每滴1枚卵子進行培養(yǎng)。7)注射后12-20小時檢查是否受精，一般受精后48小時進行全胚胎冷凍或新鮮胚胎移植。第五章.卵子輔助激活常規(guī)一、卵子輔助激活指征既往ICSI不受精或者受精率低的患者。二、激活試劑配制購置西格瑪?shù)膇onomy