發(fā)酵分析-色譜分析概述

色譜分析第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的特點、分類和作用

混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。碳酸鈣（固定相）色素混合液石油醚

(流動相）1906年，Tsweet

發(fā)現色譜分離現象色譜柱色帶植物色素分離圖示色譜法的特點（1）分離效率高

復雜混合物，有機同系物、異構體。手性異構體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析。（4）應用范圍廣

氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處：

被分離組分的定性較為困難。色譜法的分類1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分類流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜超臨界流體色譜法——流動相為超臨界流體色譜法分類（續(xù)前）2．按固定相的固定方式分類3．按分離機制分類平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細管電詠法毛細管電色譜法毛細管電泳二、色譜過程、分離原理及特點㈠色譜過程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例見圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復多次洗脫→被測組分分配系數不同→差速遷移→分離圖示分配系數的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出back㈡色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數和分配比來衡量㈢色譜分離特點

1．不同組分通過色譜柱時的遷移速度不等→提供了分離的可能性

2．各組分沿柱子擴散分布→峰寬→不利于不同組分分離三、色譜流出曲線與術語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值

保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現濃度極大值時所需的時間；

死時間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；

調整保留時間（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=

tM×F0

調整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.區(qū)域寬度

用來衡量色譜峰寬度的參數，有三種表示方法：（1）標準偏差(

)：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354

（3）峰底寬(Wb)：Wb=4

四、分配系數與色譜分離㈠分配系數和容量因子：相平衡參數分配系數K(平衡常數)：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比（色譜過程的相平衡參數）注：K為熱力學常數與組分性質、固定相性質、流動相性質及溫度有關實驗條件固定，K僅與組分性質有關五、色譜定性與定量方法1.

色譜定性分析(1)利用保留值及其規(guī)律定性各物質在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標。利用純物質對照定性利用文獻值對照定性純物質對照定性實現方法利用保留時間定性

用相對保留值定性

用已知物增加峰高法定性

文獻值對照定性分析（GC）實現方法測定保留指數I

優(yōu)點：無需純物質；保留指數具有較好的重現性和精密度；只與固定相和柱溫有關。缺點：對結構復雜的物質，缺乏數據。適用范圍：適用于簡單混合物，無需純物質。（2）與其他分析儀器聯用的定性方法SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD色質譜聯用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯用儀；組分的結構鑒定:

外標法外標法也稱為標準曲線法。特點及要求：外標法不使用校正因子，準確性較高操作條件變化對結果準確性影響較大對進樣量的準確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析

內標法原理：利用被測物與內標物校正因子的比值不變來進行定量的。首先用被測物標準品和內標物配制標準溶液，求得校正因子比值：然后，樣品中加入內標物，再由它和樣品的峰面積來計算：

fis＝fi/fs－內標物與被測組份校正因子的比值；

mi－被測組份i的含量；ms－加入內標物的量；As－內標物的峰面積；Ai－組份i的峰面積；(a)內標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結果的影響不大。(b)每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。內標物要滿足以下要求：（a）試樣中不含有該物質；（b）與被測組分性質比較接近；（c）不與試樣發(fā)生化學反應；（d）出峰位置應位于被測組分附近，且無組分峰響。內標法特點與外標法比較：1.外標法：2.內標法：可以推導出：思考題色譜分離的原理及過程。第二節(jié)薄層層析（Thin-layerchromatography）1、基本原理薄層層析法是色譜分析技術的一種

一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同組分的吸附力不一樣，不同組分在展開溶劑中的溶解度不一樣，點在薄板上的混合樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復進行，而將樣品各組分分離開來）Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTimeThin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplacesThin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis固定相：氧化鋁Acidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-硅膠吸附薄層層析吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠

硅膠：表達式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質，它的硅氧環(huán)交鏈結構表面上密布極性硅醇基（－Si－OH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產生吸附.硅膠吸附薄層層析的特點：

①硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關。②硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。③硅膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過高。2、操作步驟

—薄層板的制備

1、調漿稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化

70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時取出。展開劑的選擇1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點。每個樣品間相距約1cm。2、取樣：用毛細管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細管柱高5cm。3、點樣：點樣毛細管輕輕接觸薄層表面點樣。加樣后原點擴散直徑不超過2mm。

AlaArg

GlyMix輕觸疾起操作步驟—點樣

(a)點狀點樣(b)條狀點樣(c)頸部點樣(d)溝槽點樣半自動點樣儀手動點樣器操作步驟—

展層、顯色AlaArg

GlyMix

將薄層板點樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應低于點樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點。物理顯色含有共軛雙鍵的有機物質能吸收紫外光，將分離后的薄層板置于紫外燈下，組分薄層呈現暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有熒光指示劑的吸附劑)鋪成的薄層，在紫外光照射下，整個薄層呈顯黃綠色熒光，斑點部分呈現暗色，更為明顯。利用蒸氣熏顯色時，常用的試劑有固體碘、濃氨水、液體溴。進行顯色時，把這些易揮發(fā)的試劑放置在密閉容器內（例如標本瓶、標本缸、干燥器等），使它們的蒸氣充滿整個容器，將已展開并已揮發(fā)去溶劑的薄層板放入其中，使之顯色?；瘜W顯色的方式通常有直接噴霧法和浸漬法兩種。

化學顯色常用的顯色劑劑大致可以分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。通用顯色劑：對未知化合物的檢測，可以考慮先用通用顯色劑。這種顯色劑是利用它與被測組分的氧化還原反應、脫水反應及酸堿反應等而顯色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸堿指示劑溶液、5％磷鉬酸乙醇溶液、熒光顯色劑等。：

結果計算Rf=斑點至原點距離溶劑前緣至原點距離

小心量出斑點中心至原點中心距離，再量出原點中心至溶劑前沿的距離，計算出它們的Ｒｆ值。

根據Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類，并繪出層析圖譜。薄層色譜掃描儀

定義：紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據不同物質在兩相中的分配系數不同而進行分離的一種微量分離方法。載體——層析紙（濾紙）；固定相——濾紙上的吸濕水分；流動相——有機溶劑（展開劑）。紙色譜思考題簡述TLC的操作步驟。概念：離子交換分離法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所發(fā)生的交換反應進行分離的方法。（二）離子交換色譜儀器設備簡介離子交換全套裝置離子交換樹脂的結構-網絡骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、環(huán)氧系離子交換樹脂結構骨架：接有功能基團，本身是惰性功能基團：連接在骨架上，可與相反離子結合待交換分子：在吸附階段可與活性離子交換，與骨架上的功能基團結合活性離子：與功能基團所帶電荷相反的可移動的離子活性離子為陽離子，稱陽離子交換樹脂，與陽離子發(fā)生交換活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換基質電荷基團反離子商品名纖維素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纖維素纖維素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纖維素聚苯乙烯—————SO3-·

Na+732陽離子樹脂

聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717陰離子樹脂聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂的制備離子交換樹脂的形狀結構示意圖帶正電荷多蛋白緊密結合帶