分離工程課件

緒論

Part1

化工分離工程及其研究內容分離工程什么是化工分離工程？化工分離工程是化學工程學科的重要組成部分。化工分離工程是研究化工及其它相關過程中物質的分離和純化方法的一門技術科學。許多天然物質都以混合物的形式存在，要從其中獲得具有使用價值的一種或幾種產品，必須對混合物進行分離。在許多加工工業(yè)中，例如化工、石油化工、煉油、醫(yī)藥、食品、材料、冶金、生化等，必須對中間體和產物進行分離和提純，才能使加工過程進行下去，并得到符合使用要求的產品。分離過程還是環(huán)保工程中用于污染物脫除的一個重要環(huán)節(jié)。分離工程生產實踐是分離工程形成與發(fā)展的源泉早期的化學工廠是由化學家根據(jù)實驗室研究結果直接建立的。通過生產實踐發(fā)現(xiàn)，生產用的大裝置中的化學或物理過程與實驗室玻璃器皿中的現(xiàn)象有很大的不同。而在不同產品的生產過程中，卻有許多過程遵循相似的原理。由此提出的單元操作原理奠定了化學工程學科最初的理論基礎。分離工程即使是在一種產品的生產流程中，也有原理相似的不同操作步驟。分離工程

早在數(shù)千年前，人們已利用各種分離方法制作許多人們生活和社會發(fā)展中需要的物質。例如，利用日光蒸發(fā)海水結晶制鹽；農產品的干燥；從礦石中提煉銅、鐵、金、銀等金屬；火藥原料硫磺和木炭的制造；從植物中提取藥物；釀造葡萄酒時用布袋過濾葡萄汁；制造蒸餾酒等等。這些早期的人類生產活動都是以分散的手工業(yè)方式進行的，主要依靠世代相傳的經驗和技藝，尚未形成科學的體系。

早期人類生產活動中的分離過程分離工程

近代化學工業(yè)是伴隨著十八世紀開始的工業(yè)革命而崛起的。于十九世紀末開始了大規(guī)模的發(fā)展。當時，三酸二堿和以煤焦油為基礎的基本有機化工等都有了一定的規(guī)模。在生產中，需要將產品或生產過程的中間體從混合物中分離出來，才可供使用。例如，當時著名的索爾維制堿法中，使用了高達二十余米的純堿碳化塔，在其中同時進行化學吸收、結晶、沉降等分離過程，這是一項了不起的成就。但在當時，這項成就是由化學家在進行化學工藝過程開發(fā)的同時完成的，他們并沒有意識到他們同時在履行著化學工程師的職責。這時的分離技術是結合在具體的化工生產工藝的開發(fā)過程中，單獨而分散地發(fā)展的。近代化學工業(yè)的興起分離工程

隨著大量的工業(yè)實踐，人們逐漸認識到，各種化工生產工藝，除了其中的核心即反應過程外，大都是由為數(shù)不多的一些基本操作組成的。這些基本操作的知識對于化工過程的正確開發(fā)和化工流程、裝置的正常運行及經濟性有重要的作用。在二十世紀初提出的單元操作的概念指出：任何化工生產過程不論規(guī)模如何，皆可分解為一系列名為單元操作的過程，例如粉碎、混合、加熱、吸收、冷凝、浸取、沉降、結晶、過濾等。單元操作的概念包含了流體動力過程、傳熱過程、傳質分離過程、熱力過程、粉體工程等許多化工生產過程中常見的操作和過程，傳質分離過程是其重要組成部分。化學工程學科的雛形單元操作和化學工程理論的形成G.E.戴維斯，《化學工程手冊》(1901)C.S.魯賓遜，《精餾原理》(1922)W.K.劉易斯，W.H.麥克亞當斯，《化工原理》（1923）W.K.劉易斯的《化工計算》(1926)T.K.舍伍德的《吸收與萃取》(1937)分離工程

單元操作概念的建立對化學工程的發(fā)展起了重大的作用。它對用于不同的化學工藝中的同樣的操作，以單元操作的概念抽象出來，對其共同規(guī)律進行研究。通過對其基礎研究、單元操作所用設備的結構、操作特性、設計計算方法及應用開發(fā)等多方面的研究，為分離過程在化工工藝開發(fā)、化工過程放大、化工裝置設計和在化工生產中的正確應用提供了較為完整的理論體系和經濟高效的分離設備，對促進化學工業(yè)的發(fā)展起到了重要的作用。同時，以此為基礎發(fā)展起來了以因次分析和相似論為基礎的實驗研究方法和以數(shù)學模型方法為基本的理論結合實際的化學工程研究方法，也對化學工程學本身的發(fā)展作出了很大的貢獻。分離工程

自二十世紀五十年代以來，通過對化學工程的深入研究，提出了三傳一反（動量傳遞、熱量傳遞、質量傳遞、化學反應工程）的概念。使分離工程建立在更基本的質量傳遞的基礎上，從界面的分子現(xiàn)象和基本流體力學現(xiàn)象進行分離工程中各單元操作的基礎研究，并用定量的數(shù)學模型描述分離過程，用于分析已有的分離設備，并用于設計新的過程和設備。由于計算機技術的飛速發(fā)展，使得從較基礎的理論角度出發(fā)對分離過程和設備進行研究成為可能，減少了誤差和失真。對一些復雜的數(shù)學模型的開發(fā)并用于分離過程的優(yōu)化，使化工過程更趨成熟和完善。

分離操作是怎么實現(xiàn)的？平衡分離過程：根據(jù)當體系處于平衡時物質在不同相態(tài)（氣液、氣固、液固等）中濃度不同而實現(xiàn)分離，如蒸餾、吸收、萃取、吸附、結晶等速率分離過程：根據(jù)物質分子在外力作用下遷移速率不同而實現(xiàn)分離，如膜分離、電泳等重力和離心分離：根據(jù)物體密度不同而實現(xiàn)分離，如重力沉降、旋風分離等機械分離過程：根據(jù)物體顆粒大小不同而實現(xiàn)分離，如篩分和過濾等其他分離過程分離工程舉例：蒸餾蒸餾是分離液體混合物的主要方法之一。當對液體混合物加熱時，其中沸點較低（或揮發(fā)度較大）的組分更容易汽化，因此汽相中低沸點組分含量較高，將其冷凝，就得到低沸點組分含量較高的液體，從而實現(xiàn)了高低沸點組分的部分分離。要實現(xiàn)蒸餾分離，必須是部分蒸發(fā)，而不能完全蒸干。分離工程高效的蒸餾設備：

帶回流的直立多級精餾塔簡單的一級蒸餾往往只能實現(xiàn)液體混合物的部分分離。要提高分離的效果，可以多次重復上述部分蒸發(fā)－冷凝過程，即采用多級蒸餾。實現(xiàn)多級蒸餾的設備就是精餾塔：帶回流的直立多級蒸餾設備。一般來說，只要有足夠的級數(shù)，就有可能達到所希望的分離效果。分離工程蒸餾技術的應用和發(fā)展歷史早在二千余年前人們即用蒸餾的方法制酒和芳香油。十四世紀已有較具規(guī)模的酒精生產。十八世紀從煤焦油中用蒸餾提取油品。十九世紀中葉第一個石油煉廠投產。早期的蒸餾設備能耗大、分離效果差，十九世紀中葉，人們設計了直立多級、采用回流技術的精餾塔，被認為是蒸餾技術發(fā)展中的重大突破。精餾采用回流技術，在塔內實現(xiàn)充分的汽、液兩相多級逆流接觸傳質，能實現(xiàn)混合物的高純度分離。目前，精餾廣泛應用于煉油、化工和石油化工、輕工、食品、空氣分離等工業(yè)中，是非常重要的分離技術之一。二十世紀以來，化學工業(yè)特別是石油化工的迅速發(fā)展，在生產規(guī)模和分離難度上對蒸餾提出了更高的要求，各種生產能力大、分離效率高、流動阻力低的新型蒸餾設備不斷出現(xiàn)，常用的是各種板式塔和填料塔。不同的蒸餾方法也得到了迅速的發(fā)展，出現(xiàn)了恒沸精餾、萃取精餾、鹽精餾、反應精餾、分子蒸餾、水蒸汽蒸餾等各種復雜蒸餾方法。分離工程一些典型的分離單元操作蒸餾吸收吸附萃取結晶干燥過濾膜分離（透析、反滲透、電滲析、超濾、微濾、納濾、滲透蒸發(fā)、氣體膜分離等）新型吸附技術（模擬移動床吸附、擴張床吸附、變壓吸附）層析超臨界萃取分子蒸餾分離工程Part2

分離工程的發(fā)展促進了化學工業(yè)等過程工業(yè)的進步分離工程

分離過程作為化工生產中的一個不可缺少的環(huán)節(jié)，在化學工業(yè)的發(fā)展中起著重要而不可替代的作用。分離技術的發(fā)展和不斷取得的技術進步不僅促進了化學工業(yè)的發(fā)展，也促進了其他相關過程工業(yè)的發(fā)展，提高了生產和技術水平。煉油和石油化工分離工程

煉油和石油化工是現(xiàn)代人類工業(yè)文明中最重要的基礎加工工業(yè)之一。石油煉制工業(yè)通過煉油過程把原油加工為汽油、噴氣燃料、煤油、柴油、燃料油、潤滑油、石油蠟、石油瀝青、石油焦和各種石油化工原料等石油產品的工業(yè)。為現(xiàn)代人類文明提供了重要的能源和工業(yè)原料。石油化學工業(yè)以上述原料生產種類極多、范圍極廣的各種化學品，例如塑料、合成纖維、合成橡膠、合成洗滌劑、溶劑、涂料、農藥、染料、醫(yī)藥和各種中間體等重要產品。目前，國際上石油化學工業(yè)產品的銷售額已占到全部化工產品的45%。在大型石油化工聯(lián)合企業(yè)中，煉油和石油化工過程是緊密結合在一起的。各種分離操作是其生產過程必不可少的組成部分。分離工程

蒸餾是煉油和石化工業(yè)的最主要的基本操作過程之一。早期的煉油工業(yè)即是簡單的利用釜式蒸餾將石油的輕重組分加以分離，以生產汽油、煤油和重質油等產品的過程?，F(xiàn)在，原油仍借常壓蒸餾及減壓蒸餾按沸程不同進行分離。蒸餾技術的發(fā)展，例如精餾技術的開發(fā)、泡罩塔的應用，提高煉油生產中原油的分離效率，使大規(guī)模連續(xù)化的分離操作得以實現(xiàn)，明顯降低了設備投資、操作能耗和分離成本。二十世紀中葉以來各種生產能力大、分離效率高、流動阻力低的新型塔器的出現(xiàn)，進一步促進了煉油工業(yè)的技術進步和發(fā)展。在煉油和石化等工業(yè)的應用中取得了明顯的經濟效益，例如，美國在1950～1970年之間，通過對蒸餾設備的改進就創(chuàng)造了近二十億美元的經濟效益；在我國，用網板波紋填料對數(shù)百座舊式板式塔進行改造，使分離能力和通量均增加了30～50%。分離工程

除此以外，現(xiàn)代煉油和石化工業(yè)中還廣泛應用著其它分離單元操作。例如：萃取用于溶劑脫蠟、潤滑油精制、溶劑脫瀝青和芳烴抽提等。吸附用于分子篩脫蠟、C8芳烴分離、烯烴和烷烴的分離等。冶金和資源工業(yè)分離工程

核工業(yè)最初是在第二次世界大戰(zhàn)期間由于戰(zhàn)爭的需要而獲得超常規(guī)的高速發(fā)展的。其中，為了提取和純化鈾，對溶劑萃取技術，主要是萃取劑和萃取設備進行了大量的研究。鈾是在工業(yè)上第一個使用溶劑萃取法提取和純化的金屬元素。在鈾的溶劑萃取法提取過程中，使用的萃取劑有磷酸三丁酯（TBP）、TBP-D2EHPA-煤油混合溶劑、胺類萃取劑等。在萃取設備的研究中，開發(fā)了各種萃取設備如各種轉動塔、脈動塔、振動塔和混合澄清槽等，為萃取過程的工業(yè)實現(xiàn)提供了可靠、經濟、高效而生產能力大的分離設備。鈾、釷、钚等的萃取分離過程和氣體擴散法等同位素分離方法的工業(yè)實現(xiàn)，為核工業(yè)在戰(zhàn)后的迅速發(fā)展提供了堅實的基礎。由此而發(fā)展起來的濕法冶煉技術后來成為有色金屬和無機礦產的生產的重要方法之一。分離工程

由于礦物資源的貧化，濕法冶煉，即利用酸、堿等水溶液浸取礦物，然后其中的有用組分進行分離或凈化，受到了越來越多的重視，其中常用萃取進行分離和提純。用溶劑萃取從銅礦浸取液中提取銅，是在二十世紀七十年代在濕法冶煉中取得的一項重要成就。一般認為，只要價格相當或超過銅的有色金屬，都有可能用溶劑萃取方法進行提取。目前萃取已用于鈷、鎳、鎢、鉬、金、稀土等元素的生產過程。濕法提取過程也用于磷和硼等無機礦產的生產過程。例如，磷酸生產通常用熱法過程，產品純度高。但生產中能耗很高，成本高，要求磷礦的品位高。磷酸的濕法生產過程可以處理低品位的磷礦，生產成本低，因而得到了日益廣泛的重視。在濕法磷酸凈化的萃取法由于提取成本低，凈化程度高，而得到廣泛的研究和應用。分離技術的發(fā)展，使人們可以更有效地利用資源，并生產出品種更多、質量更好、價格更低的產品。濕法冶煉中的礦物浸取和萃取分離過程分離工程醫(yī)藥工業(yè)分離技術在保證藥物生產及其質量中起著關鍵作用。合成藥物的生產類似于精細化工產品，但質量和衛(wèi)生要求更嚴格，各種分離技術在生產中扮演著重要的角色?？股氐劝l(fā)酵類醫(yī)藥產品的生產中，大量應用著過濾、萃取、吸附、膜分離、離子交換、結晶、干燥等分離技術。在現(xiàn)代基因工程產品的生產過程中，分離成本有時甚至要占到其總生產成本的90％以上，并為此發(fā)展了許多新型的高精度分離技術。在天然藥物（如中藥等）生產現(xiàn)代化過程中，超臨界萃取、膜分離、先進的過濾、干燥、結晶等分離技術大有用武之地。分離工程其他食品、乳品和飲料工業(yè)環(huán)境保護空氣分離水處理、海水淡化、純水制備材料工業(yè)分離工程Part3

二十一世紀的化工分離工程：機遇與挑戰(zhàn)分離工程

二十世紀下半葉掀起的新技術革命浪潮在人類文明和社會發(fā)展上將具有重大的意義。在現(xiàn)代生物技術、環(huán)境科學、資源與能源科學、信息技術與材料科學等高新科技的發(fā)展對分離工程提出了新的、更高的要求，有許多是傳統(tǒng)分離技術所無能為力的，分離工程發(fā)展與高新科技的結合是現(xiàn)實的迫切需求，也是分離工程面臨的新的機遇和挑戰(zhàn)。

現(xiàn)代科學技術的迅速發(fā)展向分離工程提出了許多新的課題：現(xiàn)代生物技術產品的商品化在很大程度上取決于能否將具有生物活性的產品從組成復雜的、具有許多性質相似的雜質的稀溶液中經濟有效地加以分離純化；信息工業(yè)、生物技術和醫(yī)藥工業(yè)、材料工業(yè)的飛速發(fā)展向分離工程提出了前所未有的純度要求和分離精度要求；由于石油和天然氣資源的逐漸枯竭，能源結構在未來幾十年內將面臨重大的變化。新能源的發(fā)展要求分離工程提供新的、經濟有效的大規(guī)模分離方法；資源的開發(fā)向貧礦的利用轉化以及海洋資源的開發(fā)利用需要更經濟有效的分離技術；環(huán)境保護對分離技術提出了持續(xù)的、不斷提高的需求；為了節(jié)約能源、降低設備投資和分離操作成本，對傳統(tǒng)分離過程的改造或以新分離方法取代。分離工程現(xiàn)代生物技術產品的分離和純化分離工程

以重組DNA技術為標志的現(xiàn)代生物技術近三十年來取得了迅猛的發(fā)展。作為當代高科技的核心之一，現(xiàn)代生物技術將改變醫(yī)學、農業(yè)、食品、能源、化學、環(huán)境保護等領域的傳統(tǒng)面貌，促進人類社會生產力和科學技術的巨大進步。現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展對其下游過程，即生物技術產品的分離純化技術提出了迫切的需求。通過發(fā)酵和動、植物細胞培養(yǎng)等生成的目標產物需通過一系列的分離和純化等步驟才能獲得最終的產品。據(jù)報道，生物技術產品生產中分離提純成本一般要占其總成本的40%～90%?？梢?，分離過程在基因工程產品生產中的重要性。以基因工程產品為代表的現(xiàn)代生物技術產品的分離提純技術的開發(fā)研究是分離技術的前沿研究方向，它有著與傳統(tǒng)化工分離技術極為不同的分離對象、系統(tǒng)和特點：分離對象是具有特定的生物活性的生物大分子產品，分離過程設計中不恰當?shù)奈锢砗突瘜W環(huán)境等（如溫度、pH值、緩沖液選擇、有機溶劑、攪拌和剪切力等）皆有可能引起其蛋白質分子結構發(fā)生改變，從而使之失活；所需要的目標產物往往存在于含有許多性質十分相似的雜質的稀溶液中，如何從這樣一種復雜的稀溶液中經濟有效地提取產物是生物分離技術面臨的重大課題；從衛(wèi)生和安全角度出發(fā)，對于治療用基因工程產品，有著極高的純度和同一性要求，對其中的有害雜質去除率要求極高，對分離設備材質和分離過程中引入的分離介質也有著嚴格的限制；基因工程中所表達的外源蛋白在宿主細胞（如大腸桿菌）中往往以不溶解的無定形蛋白聚合體即包涵體的形式存在，如何使之分離純化并按正確的次序和結構復性為具有活性的最終產品是一個全新的分離技術研究領域。分離工程分離工程

通常，生物分離過程包括以下幾個處理階段：（1）培養(yǎng)液（或發(fā)酵液）的預處理和固-液分離；（2）產物提??；（3）產物純化（精制）和（4）成品加工。許多適合于生物技術產品特點的分離技術在近幾十年來得到了迅速的發(fā)展，例如離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等層析技術；超速離心分離技術；電泳技術、雙水相萃取、反膠束萃取等。為生物技術產品的生產提供了適用的分離技術。分離工程

然而，現(xiàn)在的生物分離過程往往相當復雜，步驟很多，造成分離成本高和收率下降。因此，基于經濟和大規(guī)模高效分離為目標的許多新的生物技術產品組合分離技術，例如親和膜分離、親和超濾技術、擴張床技術、高效層析技術等，已受到重視，其中有些已成功地用于生產?？梢灶A見，隨著科學技術的發(fā)展，現(xiàn)有的生物分離技術將不斷完善，新的生物分離技術還將不斷涌現(xiàn)，以適應不斷增多的生物技術產品的產業(yè)化的需要。日益增長的能源需求對分離技術的挑戰(zhàn)分離工程

目前，現(xiàn)代人類文明的進步和發(fā)展是建立在以化石燃料為主的一次性能源的基礎結構上的。然而，地球上的一次性能源資源都是有限的，由于工業(yè)生產和人民生活的需要而進行的大規(guī)模開采，已經使部分能源資源日趨枯竭，尤其是既作為能源又作為基本化工原料的石油和天然氣資源。使能源和資源能持續(xù)滿足未來發(fā)展的需要是放在科研工作者面前的緊迫任務。目前來看，這些任務包括，現(xiàn)有資源的充分利用，貧化資源的開采利用；煤、頁巖油等資源的清潔、經濟和有效的綜合利用；新能源的開發(fā)，如太陽能、核聚變、生物能源等。分離工程的進步將對這些領域研究目標的實現(xiàn)和應用起到至關重要的作用。

煤等固體礦物能源資源的清潔利用分離工程

煤和油頁巖是除石油以外的儲藏量較為豐富的礦物能源和化工原料資源。其使用不如石油方便，且對環(huán)境污染更嚴重。其有效利用及其向液態(tài)燃料轉化等方面，分離工程面臨著許多新的課題。由于資源的分散和含量、組成的復雜和處理過程的環(huán)境保護要求，使得對分離過程的開發(fā)提出了更高的要求。在用煤合成生產液態(tài)燃料的大規(guī)模應用中，也面臨著許多新的、不同于石油化工的分離問題。分離工程

現(xiàn)已普遍使用的許多化工分離技術如萃取、吸附、離子交換、膜分離等仍是大有用武之地的。對此，一個重要的方向是加強對使用于分離過程的高分離因子、高選擇性、高容量、使用壽命長易于再生循環(huán)使用的質量分離劑（分離介質）的研究，熱力學和化學在其研究中有重要的作用。另外，加強對傳質和傳遞現(xiàn)象、界面現(xiàn)象的研究，自動控制及計算機輔助過程應用于分離工程的研究，對于強化分離過程的分離效果也具有重要的意義。生物能源的利用分離工程

目前使用的化石燃料實際上是億萬年前通過生物轉化的太陽能，按目前的消耗量，其儲藏終有枯竭之時。從可再生的生物資源中獲得液體燃料將是今后能源結構中的重要組成部分。甘蔗等富含糖份和淀粉的植物是將太陽能轉化為化學能的理想植物。實際上，通過甘蔗制糖、發(fā)酵生產的乙醇，在一些國家已作為汽油的代用品用于汽車燃料。然而要使這種燃料真正具有經濟上的競爭力，必須要解決從發(fā)酵產生的乙醇稀溶液中經濟而低能耗的提取乙醇的分離技術，以降低生產成本和提高凈能量產出率。雖然對此的持續(xù)研究不斷地取得進步，但仍有待于更大的突破?？煽睾司圩兡茉吹拈_發(fā)應用分離工程

核聚變有可能成為二十一世紀的主要能源之一。可控核聚變將使輕核元素聚變成較重元素過程中釋放出的巨大能量可以利用。主要的核聚變燃料是氘和氚。氚由鋰和中子反應產生；氘在自然界以重水形式存在，可以從海水中提取得到。據(jù)估計海水中共約有200萬億噸重水，由此推算每升海水中含有的核聚變能約相當于300升汽油的化學能。因此可控核聚變如能實現(xiàn)，將成為幾乎用之不竭的能源。對此，分離工程面臨的任務是：如何以巨大的處理量經濟地從海水中提取濃度很低的重水，這需要對高效、高通量、低成本的同位素分離富集方法進行持續(xù)的開發(fā)研究。環(huán)境保護對分離工程提出的挑戰(zhàn)分離工程

環(huán)境保護是工業(yè)化社會中人們面臨的嚴峻問題。過去一百年中，隨著工業(yè)化進程的發(fā)展，人類活動對環(huán)境的破壞顯著加劇，對人類生存環(huán)境的危害越來越大。對于工業(yè)生產中排出的廢氣、廢液、廢渣等污染物，常用的處理方法是生物降解、化學降解和污染物的分離脫除。分離工程在環(huán)境保護中起著重要的作用。由于污染物種類繁多、性質復雜，環(huán)保分離技術必須針對這些特點進行開發(fā)研究。許多分離單元操作已用于環(huán)境保護中，例如吸收用于從工業(yè)燃燒廢氣中脫除二氧化硫；萃取用于從工業(yè)廢水中脫除酚和其它有害有機物以及重金屬離子等；吸附和離子交換用于處理放射性廢水；膜分離方法用于處理汽車電泳廢水；液膜分離技術用于廢水中重金屬離子的富集；等等。分離工程

進一步的開發(fā)研究還集中在對排放廢物的綜合利用上。例如對燃燒化石燃料產生的大量二氧化硫、二氧化碳等廢氣的脫除、回收和綜合利用；其中，自工業(yè)革命以來，大氣中二氧化碳的含量增加了約30％，對地球溫室效應的加劇產生了重要影響，是主要的環(huán)境污染源之一。同時，二氧化碳也是十分有用的資源。開發(fā)其資源化技術，有效降低其排放，是分離工程面臨的重大任務。目前已有多種二氧化碳的脫除方法，如吸收法、變壓吸附法和膜分離法等，用于各種工業(yè)過程中。但這些方法如直接用于環(huán)境治理中大量二氧化碳的脫除，還存在處理量小、成本過高等問題。環(huán)境治理中脫碳、固碳的問題的解決還有待于更經濟有效的分離過程的開發(fā)。根除污染物在生產過程中的產生是一種理想的環(huán)境保護方法，即所謂的“零排放”生產過程或綠色生產工藝。要做到這一點需要環(huán)保研究者、分離工程研究者和各領域的工藝開發(fā)研究者共同合作，進行大量的努力。變性與復性

Unfoldingand

Refolding

變性與復性1931年吳憲教授提出蛋白質變性理論。

若溶液中存在變性劑（酸、堿、鹽酸胍、尿素、重金屬、某些有機試劑等）能引起蛋白質變性。蛋白質變性是因維系其空間結構的次級鍵被破壞，原有的空間結構解體，蛋白質肽鏈構型調整以適應新環(huán)境。弱變性條件下，蛋白質部分變性，肽鏈保持一定結型；強變性條件下，蛋白質完全變性肽鏈伸展成無序隨機狀態(tài)。

變性與復性

變性過程總伴隨著蛋白質的物理、化學、生物學性質的變化，如溶解度改變、體積變大、黏度增加、擴散系數(shù)降低、生物活性降低或消失等。蛋白質變性時肽鏈伸展而失去特定的空間結構，這一過程稱為肽鏈的伸展或去折疊。隨著這一過程的進行，整個分子也由天然蛋白質緊密的、球狀或近球狀結構伸展為松散的無一定空間結構的鏈狀分子。許多變性蛋白質在去除變性因素后，可自發(fā)地恢復它原來的空間結構和生物活性，這稱為變性蛋白質的再折疊或復性。復性有關理論

蛋白質從去折疊狀態(tài)向折疊狀態(tài)即天然狀態(tài)轉變的過程中，必須經歷一個高自由能的過渡態(tài)。

蛋白質復性過程中能量變化示意圖復性有關理論

在這個過渡態(tài)中蛋白質可有多種構象形式，而天然狀態(tài)蛋白質可能有一種或有限的幾種構象狀態(tài)存在。蛋白質的再折疊是依據(jù)最小能量原則進行的，假設蛋白質的天然構象是能量最小的構象，變性態(tài)蛋白質分子會自發(fā)的向這個最小能量狀態(tài)轉變。這就是“熱力學假說”。該理論認為：蛋白質天然構象形成具有協(xié)同性，其能量差別足以區(qū)別天然構象和其它構象。大部分蛋白質的天然構象應是能量最小構象。復性有關理論

大量研究還發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質在體外的變性復性過程并非完全可逆，且體外復性速度遠比體內低，多肽鏈折疊過程中受到許多因素的限制，如S-S鍵重排和脯氨酰順反異構等都是折疊反應的限速步驟，實際多肽鏈在折疊過程受到動力學控制。蛋白質在折疊過程中會有兩種途徑相互競爭，一種是正確折疊形成天然構象的途徑，另一種是錯誤折疊成穩(wěn)定的非天然構象的途徑。蛋白質多肽鏈的正確折疊是一些因素在折疊動力學過程中起到控制作用。復性有關理論

“動力學假說”與“熱力學假說”并不互相否定，而是互相補充與修正，對不同蛋白質而言，二者在蛋白質多肽鏈折疊過程中所起的作用大小不同，各有特點?？傮w上，蛋白質的折疊遵循“熱力學假說”，從高能態(tài)向低能態(tài)轉變的過程又受動力學控制。一些小分子單結構域蛋白質的折疊過程相對簡單些；熱力學控制下能容易地進行可逆的變性、復性；結構比較復雜的蛋白質，特別是涉及S-S鍵重排，脯氨酰順反異構限速步驟的折疊反應，總體上受熱力學控制，但折疊途徑即動力學控制比較重要。復性有關理論

兩個理論都認同：蛋白質的折疊是蛋白質自身分子內作用的結果，是由于暴露在溶液中的疏水側鏈的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三維空間結構的蛋白質分子。

按拓撲學觀點認為：雖然蛋白質內部基團相互作用復雜，使得不同蛋白質的折疊復性過程不相同，但不同蛋白質多肽鏈穿越空間的形式可能會是相同或類似。實驗中也發(fā)現(xiàn)，蛋白質拓撲結構的氨基酸序列不改變對蛋白質的折疊速度等參數(shù)影響很很少。因此，該理論認為，蛋白質的折疊過程的許多參數(shù)及其折疊機理可能與蛋白質的拓撲結構有密切關系。蛋白質結構

蛋白質如何從具有一級結構的肽鏈形成具有生物功能的三級結構的機制是由DNA到有生物學功能蛋白質之間唯一沒有解決的問題。其研究具有重大理論意義，對利用基因工程生產活性蛋白質有重要指導意義。研究蛋白質的溶液構象、折疊途徑是揭示新生態(tài)肽鏈折疊過程的基礎。蛋白質的較低級的結構是形成更高級結構的基礎，而高級結構可能對低級結構有進一步的調整和完善作用。

蛋白質結構

蛋白質的結構層次蛋白質結構

其中，二級結構和折疊中間體的形成直接影響著球狀蛋白質的折疊和寡聚體的組裝，結構轉換和錯誤折疊往往導致蛋白質的聚合。二級結構轉換是指某些蛋白質中的α-螺旋向β-折疊轉變，它是改變蛋白質穩(wěn)定性和聚合的原因。寡聚體組裝和蛋白質的聚合遵循不同的分子機理。前者有一定的專一性，后者則是蛋白質分子的隨機集合。研究寡聚體蛋白質折疊和裝配，能夠深入地揭示蛋白質折疊和聚合問題。目前，雖然有關研究取得了很大進展，但對折疊復性還有很多未解之迷。促進與維系蛋白質折疊和天然構象的作用力

蛋白質從伸展的多肽鏈折疊成特定的天然構象在總體上受到熱力學或/和動力學控制。而在折疊的具體過程中是受到各種作用力的綜合作用進行折疊。維系蛋白質構象與促進蛋白質折疊的作用力本質上是一致的，二者的區(qū)別是前者在維系天然的靜態(tài)中起作用，而后者在多肽鏈折疊的動態(tài)過程中起作用?？傮w上看，二者都可分為四種主要類型：疏水相互作用多肽鏈處于水環(huán)境時，其非極性側鏈基團為避開極性分子而形成疏水核心，是“疏水折疊”促進與維系蛋白質折疊和天然構象的作用力

過程的主要動力，同時也是維系多肽鏈折疊狀態(tài)的主要作用力。另外，全部或部分暴露在水環(huán)境中的非極性側鏈基團也有明顯地疏水相互作用，在多肽折疊的早期中間體中起重要作用。氫鍵蛋白質內有非常多的氫鍵，具體某一氫鍵對蛋白質的構象的貢獻很小，但所有的氫鍵的力量加起來就是一個非常重要的作用，不同氫鍵對蛋白質構象的影響大小也不同，但，至少在二級結構，如α-螺旋和β-折疊的形成與維系起重要作用。促進與維系蛋白質折疊和天然構象的作用力鹽鍵多肽鏈上的眾多帶正負電荷的側鏈基團之間或與環(huán)境中的正負離子之間的靜電作用對蛋白質的穩(wěn)定性有較大影響，在蛋白質構象形成過程中也起到重要作用。二硫鍵是側鏈基團之間唯一的共價鍵，對蛋白質天然構象及折疊過程中形成的中間體具有很強的穩(wěn)定作用，在蛋白質折疊過程中起到關鍵作用。包涵體

目前用基因工程表達的蛋白質有4000多種，用E.coli表達的占90%以上，在E.coli細胞質內高水平表達的外源蛋白質，尤其是來自真核生物的蛋白質，會形成不溶性聚合物包涵體。

E.coli包涵體

包涵體

包涵體形成原因：使用高計量基因和強啟動子；大腸桿菌細胞質環(huán)境條件，如pH、離子強度、高還原電位，不同于外源蛋白質正確折疊為最終構象的條件；缺少蛋白質正確折疊的輔助因子。如催化構象互變的折疊酶，脯氨?；?反異構酶，二硫鍵異構酶，及增強折疊或阻止聚集的分子伴侶等。超表達產生的高濃度新生蛋白質由于多肽鏈不完全折疊，有利于分子疏水序列之間的相互作用，最終導致這些蛋白質的聚集和錯誤折疊。包涵體對分離純化的影響有利方面：蛋白質表達量高；抗剪切和較高溫度，對破碎細胞的方法和條件要求低；包涵體密度大，易分離；包涵體的蛋白質純度較高；后續(xù)蛋白質分離純化較容易。不利方面：需變性復性；活性蛋白質收率低。包涵體的分離破碎細胞，可耐受較高溫度和破碎條件；離心沉淀包涵體，離心力較低，除去碎片；洗滌包涵體，包涵體的目的蛋白質含量為80%左右，含有酯類，蛋白，可用含低濃度的變性劑，如尿素、鹽酸胍、TritonX-100，脫氧膽酸鈉的緩沖液反復洗滌，黏度高時可用DNAse、溶菌酶處理，甚至于可用稀NaOH溶液洗滌，獲得較純的包涵體。包涵體的分離1.用表面活性劑和NaCl

混合物洗兩次3.標準蛋白質5.表面活性劑洗兩次6.細胞破碎物包涵體的溶解

包涵體的溶解需要打斷蛋白質分子內和分子間的共價鍵（二硫鍵）、離子鍵、疏水作用及靜電作用等，使多肽鏈伸展。因此，包涵體的溶解需要強的變性劑，如尿素、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或表面活性劑，如SDS、十六烷基三甲基銨氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸鈉等；對于含半胱氨酸的蛋白質，還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)、二硫基赤蘚糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽等使S-S鍵斷裂。包涵體的溶解

由于金屬離子具有催化氧化作用，需加金屬離子螯合劑，如EDTA、EGTA。

溫度一般25℃~30℃，以促進溶解。也有用70%甲酸溶解包涵體。在細胞周質內形成的包涵體，可采用原位溶解法。即在發(fā)酵結束時向培養(yǎng)基中加入變性劑和還原劑，在堿性條件下進行包涵體原位溶解（增加細胞膜的通透性，使包涵體溶解出來），無需采用其它破碎細胞方法，再采用雙水相萃取除去細胞碎片，獲得包涵體溶解液。

蛋白質的復性

復性簡單地說就是脫除變性劑使溶解的包涵體蛋白質的伸展肽鏈折疊成正確的空間結構。蛋白質的折疊復性過程及聚集體的產生蛋白質的復性

在復性過程中，處于伸展狀態(tài)的肽鏈，因暴露在外面的疏水側鏈基團之間的相互作用而使這些分子很容易發(fā)生聚集反應，形成沉淀，這是大多數(shù)蛋白質復性率低的一個主要原因。好的復性方法應能夠最大程度的抑制蛋白質的聚集反應，促進蛋白質向折疊成正確的空間結構方向反應。探索高效、方便的蛋白質復性方法對于基因工程產品和理論研究均有重要意義。實踐證明，由于蛋白質自身的復雜性和多樣性，沒有那一種復性方法適用于所有的蛋白質。蛋白質的復性

目前發(fā)展的復性方法：稀釋復性透析、透濾復性分子伴侶指導復性色譜法復性：凝膠過濾色譜復性、離子交換色譜復性、疏水色譜復性、親合色譜復性反膠團復性雙水相復性蛋白質的復性一個有效、理想的折疊復性方法應具備以下特點：活性蛋白質回收率高；正確復性產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品；折疊復性方法易放大；復性過程耗時少。就工業(yè)應用，要求折疊復性過程要快速、低成本、高效。雖然蛋白質折疊復性方法很多，但就某種蛋白質仍需通過實驗確定最佳方法和條件。稀釋復性法

這是目前最簡單的蛋白質復性方法。將少量的變性蛋白質溶液以一定比例滴加到復性緩沖液中，達到降低變性劑濃度的目的，使處于變性伸展狀態(tài)的蛋白質分子在溶液中自發(fā)地折疊成天然的活性結構。為獲得好的復性結果，必須進行復性條件優(yōu)化。因復性原理不清楚，只能通過實驗來確定。一般可采用正交法。影響復性的條件主要有：變性蛋白質溶液組成及濃度、復性緩沖液的組成（離子種類、氧化還原試劑、螯合劑）、離子強度、pH、氧化還原電位、復性溫度、稀釋倍數(shù)、混合方式速度等。稀釋復性法正交法優(yōu)化復性條件稀釋復性法變性蛋白質濃度對復性的影響稀釋復性法復性緩沖液pH對復性的影響稀釋復性法復性溫度對蛋白質復性的影響稀釋復性法復性時間對蛋白質復性的影響稀釋復性法精氨酸濃度對蛋白質復性的影響稀釋復性法鹽酸胍濃度對復性的影響稀釋復性法

不同蛋白質因其結構和變性條件及程度的差異，復性條件和影響因素不同，結果也不同。研究控制復性條件和因素的目的是最大限度抑制聚集反應，促進正確折疊反應，達到最大的復性率。伸展蛋白質分子的聚集反應是兩個分子或多個分子之間的反應，在動力學上屬于二級以上的反應，而正確折疊反應是單個蛋白質分子的自我組裝過程，動力學多屬于一級反應。兩者相比，聚集反應與蛋白質濃度的關系更大。在低濃度進行復性有利于控制聚集反應。稀釋復性法

通常，復性的蛋白質濃度為10~50μg/mL。存在蛋白質濃度低復性率高，蛋白質濃度高復性率低的矛盾。操作方式一次性稀釋：操作方式，速度分段稀釋：一般采用兩步法，先將變性劑濃度降低到一中間濃度，最后再完全除去。連續(xù)稀釋：變性蛋白質溶液與復性溶液按一定比例連續(xù)混合，復性。分段和連續(xù)稀釋法的復性回收率高于一次性稀釋。稀釋復性法分段稀釋復性時時間間隔對復性率的影響稀釋復性法簡單稀釋和分段稀釋復性比較稀釋復性法

稀釋復性應用于大規(guī)模生產的問題：復性緩沖液量大，體積大，設備利用率低；蛋白質濃度低，產物回收困難；稀釋復性法是其他復性法的基礎。對一個新的包涵體蛋白質復性時，首選的方法是稀釋復性法。從中獲得的條件和認知可供其它方法參考。蛋白質復性時聚集反應的抑制

復性中最重要的是抑制復性過程的聚集反應。最常用的是使用聚集反應的抑制劑，其原理為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質的天然結構，降低錯誤折疊蛋白質的穩(wěn)定性，增加折疊復性中間體的溶解度，增加非折疊蛋白質的溶解度，減少復性中間體接觸發(fā)生聚集反應。蛋白質復性時聚集反應的抑制聚集反應抑制劑的種類：可促進蛋白質折疊的小分子添加劑，如鹽酸胍或尿素，以及一些離液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺類化合物等。在非變性濃度下，是很有效的促進劑。對于某些需要輔因子才表現(xiàn)活性的蛋白質，輔因子、配基、或底物具有很好促進折疊的作用。

Zn2+

和Cu2+可穩(wěn)定折疊中間體。濃度為0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折疊效率（使不正確折疊和二硫鍵不穩(wěn)定）。蛋白質復性時聚集反應的抑制PEG促進折疊復性，PEG與復性中間體特異形成非聚集的復合物，阻止復性時疏水中間體的聚集，復合物折疊形成第二個中間體，并不再與PEG結合。天然蛋白質即由第二個中間體形成。在有PEG存在下的所有的折疊反應具有相同的速率，復性率與PEG的分子量及濃度相關。認為PEG的作用與分子伴侶的作用機理相似。蛋白質復性時聚集反應的抑制非離子型表面活性劑，尤其是離子型或兩性離子表面活性劑。如Chaps、TritonX-100、磷脂、十二烷基麥芽糖苷、磺酸甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用。使用它們的不利是與蛋白質形成膠團，難以去除，影響后續(xù)的分離純化。多離子化合物，如肝素，可促進蛋白質的折疊復性，且有穩(wěn)定蛋白質天然構型的作用。蛋白質復性時聚集反應的抑制短鏈醇類、高滲物，如乙醇、甘油等對蛋白質有穩(wěn)定作用，可有效降低低聚體的形成。如胰島素生長因子I的復性，除了在復性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、鹽類（1mol/LNaCl、DTT）外，還加入乙醇、甘油等。單克隆抗體，待折疊復性的蛋白質的抗體可有效的協(xié)助其復性，但只有該蛋白質的特異抗體有效。它可與待折疊復性的蛋白質的遠離活性中心的疏水區(qū)域結合，有效阻止無活性聚集體的形成。蛋白質復性時聚集反應的抑制分子伴侶和折疊酶，這類蛋白質主要包括硫氧還蛋白、二硫鍵異構酶(PDI)、肽酰-脯氨酰順反異構酶(PPI)、分子伴侶、FK506結合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶不僅可在細胞內調節(jié)蛋白質的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質折疊復性。由于分子伴侶和折疊酶在蛋白質復性后要除去，且這類蛋白質又十分昂貴，須采用可回收的方法，如固定化方法。人工伴侶，將變性蛋白質首先加到含表面活性劑的溶液中，以防聚集，然后用環(huán)糊精除去表面活性劑，促進折疊復性。這稱為人工伴侶復性。蛋白質復性時聚集反應的抑制

常用的蛋白質復性添加劑復性添加劑復性蛋白質溶液增熵試劑GdmCl熒光假單孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶II，干擾素-β-多肽尿素豬生長激素，溶菌酶，IGF-1，干擾素-β-多肽L-精氨酸熒光假單孢菌脂肪酶，雞卵清溶菌酶，α-糖苷酶鹽類(NH4)2SO4

溶菌酶糖類甘油熒光假單孢菌脂肪酶，溶菌酶，IGF-1蔗糖IGF-1葡萄糖溶菌酶N-乙酰基葡糖胺溶菌酶肌氨酸溶菌酶蛋白質復性時聚集反應的抑制表面活性劑類ChapsTGF-β-類蛋白質，碳酸酐酶IITween人生長激素SDS干擾素-β-多肽月桂酰基肌氨酸鈉單鏈Fv片段十二烷基麥芽糖MHCTritonX-100碳酸酐酶IIPEG碳酸酐酶II十八烯甘油碳酸酐酶II單十二?；姿狨ト芫噶虼鸩藟A雞卵清溶菌酶短鏈醇

正戊醇，正己醇，碳酸酐酶環(huán)己醇蛋白質復性時聚集反應的抑制

分子內沒有S-S鍵的蛋白質復性相對比較簡單，只需抑制聚集反應，不涉及S-S鍵的形成。

S-S鍵的形成需要適當?shù)难趸€原條件，對于稀釋復性法，最簡單的方法是通入空氣，進行氧化形成S-S鍵，但氧化速度太慢；最常采用的是適當比例的氧化還原對，如GSH/GSSG,形成S-S鍵，或使錯誤S-S鍵重排，促進正確S-S鍵的形成。蛋白質復性時聚集反應的抑制

影響二硫鍵重排和組建的因素

如果復性蛋白質含有二硫鍵，在復性緩沖液中需加入還原型及氧化型低分子量的巰基試劑的混合物，如谷胱甘肽、半胱氨酸、巰基蘇糖醇等，其還原型(13mmol/L)與氧化型的摩爾比為1:1到10:1。這樣的氧化還原系統(tǒng)實際上給蛋白質形成一個還原環(huán)境，形成游離的巰基，實際上形成正確的S-S鍵在此環(huán)境中也可能被還原。因此，還需在后續(xù)步驟加入強的氧化步驟，即加入過量的氧化型巰基試劑，或采用Cu2+誘導的空氣氧化，以保證形成正確穩(wěn)定的S-S鍵。

巰基氧化還原型試劑比例對復性的影響二硫鍵重排和組建二硫鍵重排和組建

在有氧化還原對存在下，復性緩沖液的pH也很重要，形成S-S鍵的氧化反應，需要堿性條件下進行。透析復性法

透析法也是最傳統(tǒng)、應用最普遍的蛋白質折疊復性方法。包括借助超濾實現(xiàn)復性的透濾復性法。由于變性劑均為小分子物質，在透析或超濾時可逐漸透過多孔膜，使變性蛋白質溶液的變性劑濃度逐漸降低，最后除去變性劑，達到使變性蛋白質折疊復性的目的。影響透析和透濾復性的因素與稀釋復性復性基本相同。但過程緩慢，耗時間長，效率低。對某些蛋白質復性率高于稀釋復性法。色譜復性法

在色譜過程中實現(xiàn)復性，稱為色譜復性法。近年發(fā)展十分迅速。其優(yōu)點是：色譜固定相對變性蛋白質吸附能力低，甚至完全消除變性蛋白質在脫離變性劑的環(huán)境發(fā)生聚集，產生沉淀。提高復性質量和活性收率。在蛋白質復性的同時可使目的蛋白質與雜蛋白質分離，達到復性與純化同時進行的目的。便于回收變性劑，有利于降低廢水處理成本。適合蛋白質復性的色譜有：凝膠過濾色譜(GFC)、離子交換色譜(IEC)、疏水色譜(HIC)、親合色譜(AFC).凝膠過濾復性

凝膠過濾色譜是以溶液中分子的流體力學體積大小進行混合物分離的技術。物料在色譜柱中的保留體積不會超出色譜柱中的溶劑的總體積，保留時間短，溶質峰相對較窄，容易檢出，靈敏度高。溶質的保留時間可粗略估計，能夠把握間隔進料的時間，進行色譜柱的連續(xù)使用，提高使用效率。溶質分子之間及溶質與分離介質之間無相互作用，活性分子不易變性，活性收率高。凝膠過濾復性

由于上述特點，凝膠過濾色譜近年開始用于蛋白質復性。在凝膠過濾復性時，先用復性緩沖液平衡凝膠柱，變性蛋白質溶液上樣后進入柱頂，因有高濃度變性劑存在，變性蛋白質有一個隨機構象狀態(tài)和大的動力學水合半徑，不能進入介質內空隙，在柱上不能保留。在用復性緩沖液洗脫時，因變性蛋白質溶液逐步被稀釋，變性劑和蛋白質濃度降低，使變性蛋白質處于熱力學不穩(wěn)定的高能狀態(tài)，蛋白質分子會自發(fā)地向熱力學穩(wěn)定的低能態(tài)，即蛋白質的天然狀態(tài)轉化，使蛋白質開始復性。凝膠過濾復性

局部復性的蛋白質體積變小，可進入介質內部，開始在液-固兩相間分配，隨時間推移，當?shù)鞍踪|分子結構變得更加緊密時，蛋白質在兩相中的分配系數(shù)會逐漸增加。蛋白質進入介質顆粒內部空隙后，其擴散速度減緩，從而限制了蛋白質的聚集，減少了沉淀產生。蛋白質分子大，先從柱子上洗脫，變性劑分子小，最后流出色譜柱。達到復性目的。凝膠過濾色譜對蛋白質本身性質沒有特殊要求，只要選擇合適分離范圍的凝膠介質即可。因此，方法比較簡單。凝膠過濾復性凝膠過濾色譜復性圖譜圖凝膠過濾復性變性蛋白質溶液中的DTT對凝膠過濾色譜復性的影響A用SephadexG25除去

DTTB未除去DTT凝膠過濾復性除去DTT后酸化變性蛋白質溶液對復性的影響×不酸化直接脫除DTT＋酸化后脫除

DTT凝膠過濾復性凝膠過濾色譜復性時不同介質對復性的影響凝膠過濾復性不同變性蛋白質濃度對凝膠過濾色譜復性的影響凝膠過濾復性尿素濃度梯度凝膠過濾復性A:Tris-HCl0.1m0l/L,EDTA1mmol/L,GSH/GSSG=3/0.3mol/LB:Urea8mol/L洗脫液：B尿素梯度凝膠過濾復性尿素濃度梯度凝膠過濾復性過程尿素梯度凝膠過濾復性尿素梯度對蛋白質復性的影響尿素梯度凝膠過濾復性尿素最終濃度對蛋白質回收率的影響尿素梯度凝膠過濾復性梯度長度對蛋白質復性活性回收率的影響尿素梯度凝膠過濾復性洗脫液流速對復性蛋白質活性回收率的影響尿素梯度凝膠過濾復性

變性蛋白質濃度對稀釋復性、凝膠過濾復性和尿素梯度凝膠過濾復性影響的比較尿素梯度凝膠過濾復性三種復性方法的活性回收率的比較凝膠過濾復性尿素濃度和pH聯(lián)合梯度凝膠過濾色譜復性親合色譜復性

是利用配體與目標蛋白質之間的特異親合作用，使變性蛋白質分子保留在柱的頂端與變性劑分離，而后在洗脫過程中進行復性。依使用的配體，用于復性的親合色譜有：抗體親合色譜、金屬親合色譜(IMAC)、脂質體親合色譜和分子伴侶親合色譜等。因配體與目標蛋白質間的作用特異性強，且不同配體與不同蛋白質之間的作用差別大，親合色譜作為蛋白質復性的機理比較復雜。親合色譜復性

單鏈抗體融合蛋白scFv57P包涵體的復性。以與scFv57P有特異性結合的小肽C19V為配體的親合色譜復性。親合色譜復性

以金屬離子為配體的親合色譜復性法

如以Ni2+為親合配體，可與末端標記有組氨酸的蛋白質分子有特異的親合作用，而這種作用又不受強變性劑的影響，可用于重組蛋白質的復性。親合色譜復性

脂質體親合色譜復性脂質體作為配體用于蛋白質復性的原理可能是：局部變形的蛋白質分子結構類似于融球狀態(tài)，與具有天然蛋白質相似的二級結構，此時，蛋白質分子仍然具有強的疏水表面，可同脂質體的脂質雙層作用，以幫助蛋白質進行復性。比如碳酸酐脫氫酶的復性使用脂質體的柱子，活性收率為83%，不用為58%。親合色譜復性

伴侶親合色譜復性分子伴侶是介導表達蛋白質建立天然構象的一類重要蛋白質，也是蛋白質體外折疊復性過程的輔助因子。在復性溶液中加入分子伴侶可提高蛋白質的復性效率，但溶液中引入了雜蛋白，給目的蛋白質分離純化帶來麻煩，且它價格昂貴，而無法應用。而將分子伴侶結合在適當?shù)慕橘|上構成分子伴侶親合色譜介質，用于目的蛋白質的復性可克服上述缺點。親合色譜復性

分子伴侶親合色譜介導的蛋白質復性與它在溶液中的作用一樣。為變性蛋白質提供一個中空環(huán)狀的疏水腔，當變性蛋白質進入空腔后，可部分避免或完全消除變性蛋白質分子間的聚集作用，使蛋白質在疏水環(huán)境中進行“結合-釋放-再結合”的循環(huán)過程，直到恢復其天然的構象狀態(tài)。利用合成的復雜的固定相體系成功地使一些用稀釋法無法復性的蛋白質復性，因此，它又稱為“折疊色譜”。疏水色譜復性

當變性蛋白質與變性劑、雜蛋白進入疏水色譜系統(tǒng)時，由于疏水固定相對變性劑的作用較弱，而對變性蛋白質的作用較強，變性劑首先與與變性蛋白質分離，并隨流動相一同流出色譜柱；而疏水固定相提供較通常方法高出數(shù)十倍乃至數(shù)百倍的能量，在變性蛋白質被疏水固定相吸附的同時瞬時除去以水合狀態(tài)附著在蛋白質表面和固定相表面接觸域的水分子，而蛋白質特定的疏水氨基酸殘基與疏水固定相表面作用形成區(qū)域立體結構，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷在固定相表面進行疏水色譜復性

吸附-解吸-再吸附，在此過程中，變性蛋白質逐漸復性，形成與天然蛋白質結構相同的蛋白質，流出色譜柱。在此過程中，不同蛋白質與固定相的作用強弱不同，復性的目標蛋白質可與大部分雜蛋白進行分離。利用疏水色譜復性rhIFN-γ和rhIFN–α，一次色譜復性達到85%的純度，活性回收率比稀釋法高2-3倍?？蓪庾冃詣腅.coli提取的目標蛋白質直接進行多種變性蛋白質的復性和同時純化。離子交換色譜復性

變性蛋白質、變性劑及變性液中的其他組分與離子交換介質間的電荷作用，使它們吸附在離子交換固定相表面，由于這些組分與離子交換介質的吸附能力的差別，在洗脫過程中進行不斷地吸附-解吸-再吸附的過程，使變性蛋白質與變性劑逐漸分離，并在吸附-解吸的過程中進行復性過程。如單鏈抗體融合蛋白質HPV16E7MSZ的復性是使用強陰離子交換色譜進行復性。使用0.01mol/LNaOH、1%SDS和8mol/L尿素溶解HPV16E7MSZ包涵體，MonoQ柱進行復性和離子交換色譜復性

純化；如果使用NaOH溶解包涵體，可直接用MonoQ柱進行復性和純化。使用DEAE-纖維素為色譜介質，對重組白細胞分泌抑制因子進行復性和純化，得到的復性蛋白質濃度比稀釋法提高6.5倍，復性收率為46%，質量回收率為96%，時間為5min。各種色譜復性方法的比較凝膠過濾色譜(SEC)復性法：復性分離過程中，變性蛋白質分子逐漸變小，柱負荷小，產物濃度低，復性分離時間長，效率較低。離子交換色譜(IEC)復性法：柱負荷大，分離效果尚好，最常用的變性劑鹽酸胍在柱保留，影響柱容量，且往往與蛋白質一起洗脫，使鹽酸胍的使用受到限制。親合色譜(AFC)復性法：因蛋白質與介質有特異的相互作用，變性蛋白質分子間聚集反應少，使原不可逆折疊的蛋白質變成可逆，是強有力的復性手段。但使用范圍窄，分子伴侶昂貴，時間長。各種色譜復性方法的比較疏水色譜(HIC)復性法：從高濃度鹽溶液中吸附蛋白質，與變性劑瞬間分離，大大降低蛋白質分子間的聚集，為復性可提供疏水環(huán)境，有利于復性，若采用梯度洗脫，有利復性和分離，活性收率高，90%以上。色譜復性方法的問題：在復性過程中不可避免地還是會產生聚集形成沉淀，造成色譜柱的壅塞，柱壓很快升高，報廢。較難放大。展望研究蛋白質變性復性機理，開發(fā)新的變性復性原理和技術，解決目前的技術關鍵。完善現(xiàn)有技術，實現(xiàn)現(xiàn)有技術的實用化和規(guī)?；?。根據(jù)現(xiàn)有技術原理，擴大應用范圍。開發(fā)實用的設備。

超臨界萃取什么是超臨界流體

超臨界流體（SCF）是指物質的壓力和溫度同時超過其臨界壓力(Pc)和臨界溫度(Tc)時的流體。即，T>Tc，P>Pc分離工程超臨界流體不是液體，也不是通常狀態(tài)下的氣體，是一種特定狀態(tài)的流體分離工程1、處于臨界點狀態(tài)的物質可實現(xiàn)從液態(tài)到氣態(tài)的連續(xù)過渡，兩相界面消失，汽化熱為零。2、超過臨界點的物質（T>Tc

），不論壓力有多大，都不會使其液化，壓力的變化只引起流體密度的變化。

超臨界流體萃?。⊿FE，SupercriticalFluidExtraction）是利用流體在臨界點附近所具有的特殊溶解性能而進行的一種化工分離過程。分離工程超臨界萃取的發(fā)展1879年Hanney和Hogarth發(fā)表了他們研究非揮發(fā)性無機鹽，如氯化鈷、碘化鉀、溴化鉀等在超臨界乙醇中的溶解現(xiàn)象。1905年，Buchner首先研究了萘在超臨界CO2中的溶解。接著人們研究了蒽、菲、樟腦苯甲酸等揮發(fā)性有機物在超臨界CO2、甲烷、乙烷、乙烯、三氟甲烷等中的溶解現(xiàn)象。分離工程

1955年，Todd和Eling提出超臨界流體用于分離的理論，同時出現(xiàn)了相關的專利。20世紀70年代的能源危機，使節(jié)能成為熱點。無相變的超臨界流體萃取迅速發(fā)展起來，人們期待用SFE分離醇和水的混合物，替代高能耗的精餾。分離工程1978年，德國建成了超臨界流體萃取咖啡因的工業(yè)化裝置；1979年，美國的Kerr—McGee開發(fā)了超臨界流體處理渣油的工業(yè)化裝置。分離工程

1982年，德國建成超臨界CO2萃取啤酒花的大型裝置，年處理5000噸；我國在八十年代開始超臨界流體萃取研究，國家在“八五”期間進行產業(yè)化攻關。1994年，廣州南方面粉廠從德國伍德（UHDE）公司進口一套萃取器為300升的超臨界萃取裝置，生產小麥胚芽油?，F(xiàn)在最大的生產裝置，萃取器體積為1500升。分離工程超臨界流體的PVT關系分離工程1822年，Cagniarddelatour首次發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，物質可實現(xiàn)從液體到氣體的連續(xù)過渡，這就是最早觀察到的臨界現(xiàn)象（見圖）。

1869年，英國皇家學院的ThomasAndrews畫出了CO2的Pr(P/Pc)—Tr(T/Tc)—ρr(ρ/ρc)狀態(tài)圖。在臨界點上：對于理想流體，P-V-T的關系表示如下：

PV=nRT對于帶壓力的體系，1873年J.D.vanderWaals給出了如下的計算式：分離工程分離工程分離工程Soave-Redlich-Kwong方程分離工程Peng-Robinson方程分離工程對于混合物，其混合規(guī)則為：分離工程分離工程物質在超臨界流體中的溶解度計算分離工程假設物質溶解經歷如下過程：（1）溶質分子A由其主流擴散到二相界面；（2）分子A穿過界面進入溶劑相；（3）分子A在界面上或和溶劑相內與溶劑分子B發(fā)生締合作用分離工程

式（1）、（2）的平衡常數(shù)可分別表示為：合并式（1）及（2）有(5)其平衡常數(shù)K為：分離工程

對于反應式（1）的廣義理解為：n=0時，意味著無締合反應，僅有A的相平衡時，K不是無意義，而是K≡1。若被萃取相中組分的摩爾濃度用x表示，超臨界相中組分的摩爾濃度用y表示。分離工程設溶劑為1；溶質為2；溶質與溶劑的反應物ABn為3，且認為y2很小，即溶質在超臨界相中基本上以ABn的形式存在。則

（7）令y3=y

則y1=(1-y) （8）分逸度可用下式表示：(9)(10)分離工程將式（9）、（10）代入（6），整理后得： (11）將溶質在系統(tǒng)溫度壓力下的純態(tài)定為標準態(tài)，則

（12）又有 （13）分離工程上式積分得:

(14)將式（12）、（14）代入式（11）得

(15)上式中n可以是小數(shù)，因為在締合時n個溶質分子可以共用一個溶劑分子結合。分離工程當n=0時，即溶質與溶劑不締合，k≡1。對于純固體，則x2=1,γ2=1,且，并假設組分2的摩爾體積不隨壓力變化，則式（15）變?yōu)椋?16)(17)分離工程

對于純固體，其蒸汽壓較低，所以φ2*≈1，而在常壓到100atm范圍內。Poynting修正數(shù)仍不大于2。因此φ2是導致增強因子增大的主要原因。例如萘-乙烯體系，在壓力為10MPa時，萘在氣相的逸度系數(shù)φ2＜＜1，使增強因子E高達25000。E稱為增強因子，E的物理意義為固體溶質在超臨界流體相中溶解度增大的量度，含有φ2*和φ2及指數(shù)項，指數(shù)項稱為Poynting修正數(shù)。分離工程

增強因子的計算歸結為溶質組分在超臨界流體中逸度系數(shù)的計算，而逸度系數(shù)的計算需通過合適的狀態(tài)方程。如用SRK方程通過計算，得到的萘溶解度值與實驗值相當一致。對三元體系也能很好地吻合，且發(fā)現(xiàn)，在低揮發(fā)性組分中加入揮發(fā)度相對較大的組分后，低揮發(fā)性組分的溶解度提高，在實際應用中就是加攜帶劑的作用。部分物質的超臨界參數(shù)分離工程分離工程由上表中可見：大部分碳氫化合物其臨界壓力在5MPa左右；對低碳烴化物，如乙烯、乙烷等，其臨界溫度近常溫，而環(huán)狀的脂肪烴和芳香烴具有較高的臨界溫度；水和氨具有較高的臨界溫度和壓力，這是因為極性大和氫鍵的緣故；二氧化碳具有溫和的臨界溫度和相對較低的臨界壓力，為最常用的超臨界流體；對于臨界溫度在0～100℃范圍的流體，適用于提取天然植物有效成分。分離工程(1)

故壓力微小變化可引起流體密度的巨大變化(2)擴散系數(shù)與氣體相近，密度與液體相近。(3)密度隨壓力的變化而連續(xù)變化，壓力升高，密度增加。(4)介電常數(shù)隨壓力的增大而增加。 這些性質使得超臨界流體比氣體有更大的溶解能力；比液體有更快的傳遞速率。超臨界流體的特性分離工程超臨界萃取原理分離工程圖中：E—S為恒溫減壓分離過程

D——P為恒壓升溫分離過程超臨界CO2萃取萘過程分離工程超臨界萃取通常有四種工藝流程：分離工程等溫降壓過程是應用最方便的一種流程。流體經升壓后達到超臨界狀態(tài)，到達狀態(tài)點1，流體經換熱后進入萃取器與物料接觸，溶解溶質，此過程壓力保持不變，在狀態(tài)點2。然后萃取物料通過減壓進入分離器，到達狀態(tài)點3，此時由于減壓而使流體的溶解能力下降，溶質析出，減壓后的流體經壓縮后回到狀態(tài)點1，進行下一個循環(huán)。等溫降壓過程分離工程等壓情況下，通過改變過程的溫度也能實現(xiàn)溶質的萃取和分離。但溫度對溶質溶解度的變化比較復雜，在轉變壓力以下，溫度增加溶解能力下降；在轉變壓力以上，溫度下降，溶解能力下降。等壓變溫過程分離工程在分離器內放置能吸附被萃取物的吸附劑，可實現(xiàn)等壓、等溫下的萃取和分離，此時壓縮機只用于克服循環(huán)阻力。但由于涉及到吸附劑的再生，故此流程適用于被萃取物較少的去雜質過程。使用吸附劑的過程分離工程超臨界流體中加入惰性氣體，如CO2中加入氮氣或氬氣可降低其溶解能力，達到分離溶質。此過程為恒溫、恒壓，但牽涉到混合氣體的分離回收。加入惰性氣體的過程植物細胞超臨界萃取的傳質模型分離工程分離工程

超臨界流體從固定床填充的固體原料中提取有效成分的過程，類似于固定床中脫附過程，在吸附/脫附速率較快時，流體經過一段較短的床層后，即達到飽和；當萃取速度快時，超臨界流體經過一段較短床層后，即達到萃取溶解飽和。分離工程假設：1)流體通過萃取器內填料層時為一維無返混活塞流；

2)超臨界流體接觸原料層后便開始溶解溶質，直到流體內溶質飽和。萃取過程中，溶質從固體相進入超臨界流體，可以簡化成二步：1)溶質分子由其主體相內部擴散到兩相界面；

2)溶質分子擴散溶解到超臨界流體主流相中。分離工程式中：C*為溶質在CO2中的飽和濃度；Ct為任一時刻的濃度；tR為CO2經過提取過渡層的時間；Ka為總傳質系數(shù)；a為單位原料體積傳質表面積。萃取過程影響因素分離工程壓力——當溫度恒定時，溶劑的溶解能力隨著壓力的增加而增加。溫度——當壓力較高時，較高的溫度可獲得較高的萃取速率。一方面是物質的蒸汽壓隨著溫度的增加而增加，另一方面，傳遞速率隨溫度增加而增加。物料顆粒度——顆粒過大，固體內傳質控制，萃取速率慢。在這種情況下，提高壓力對萃取速率影響不明顯。顆粒過小，細小的顆粒形成緊密的固體床層，影響傳質。溶劑比——溶劑比大，溶劑循環(huán)量大；溶劑比小，萃取時間長。分離工程超臨界流體萃取過程的應用實例超臨界萃取裝置中藥材分離工程鋼瓶壓縮機儲氣柜過濾器萃取器分離器吸收器流量計泵恒溫器恒溫器泵分離器超臨界流體提取工藝流程圖卵磷脂的提取分離工程丹參有效成分的提取分離工程桂花香料分離工程樹蘭香料分離工程當歸分離工程分離工程

設備投資較高：高壓裝置和高壓設備，投資費用高，安全要求亦高。操作費用高：超臨界流體溶解度相對較低，故需要大量流體循環(huán)。超臨界萃取過程，處理的原料以固體物系居多，需要經常進行固體的裝料和卸料，連續(xù)化生產較困難。高壓下萃取過程，物性數(shù)據(jù)缺乏。需要對超臨界流體熱力學的深入研究和基礎數(shù)據(jù)的積累，使得過程的設計和優(yōu)化得到更多的理論支持。

超臨界萃取的局限性

萃取簡介

液-液萃取也稱為溶劑萃取。是一個重要的傳質分離過程。在液-液萃取過程中，含有待分離組分（溶質A）的液相（料液F，為溶質A溶解于載體C的溶液，萃取后成為萃余相），與另一個與之不互溶或部分互溶的液相（溶劑S）接觸，由于溶劑S也能溶解溶質A，但不能或極少溶解C，溶質A通過相際傳質進入溶劑S，成為萃取相E，從而實現(xiàn)了對溶質A的提取，即A和C的分離。這是一個包含A、C和S的三元體系的萃取過程。

如果料液中含有多種溶質，由于溶劑S對它們的溶解度不同，也可實現(xiàn)對它們的分離。

由于溶質在兩個液相中的分配平衡的限制，通常通過一次液-液平衡接觸不能完全達到分離或提取率的要求。在這種情況下，需要通過多級逆流接觸才能達到要求。

據(jù)Derry和Williams研究，最早的液-液萃取實踐在羅馬時代即有了，當時采用熔融的鉛為溶劑從熔融的銅中