發(fā)酵工程下游加工過程概論

第十二章發(fā)酵工程下游加工過程簡介一、發(fā)酵工程下游加工過程概論1、發(fā)酵工程下游加工過程的特點(diǎn)1〕所需產(chǎn)物在培育液中濃度較低，且穩(wěn)定性差2〕普遍存在下游工程代價(jià)高，回收率較低等問題發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)2、發(fā)酵工程下游加工過程的普通程序廢品加工發(fā)酵液的預(yù)處置和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術(shù)加速固、液分別；如產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還要進(jìn)展細(xì)胞破碎提取〔初步純化〕目的是除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差別大的雜質(zhì)精制〔高度純化〕是采用對產(chǎn)品有高度選擇性的分別技術(shù)，除去與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)相近的雜質(zhì)最終獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品3、主要操作單元：絮凝離心過濾細(xì)胞破碎萃取沉淀層析結(jié)晶枯燥二、發(fā)酵液預(yù)處置和過濾為什么要對發(fā)酵液進(jìn)展預(yù)處置？預(yù)處置的目的是什么？發(fā)酵液的根本特性產(chǎn)物濃度低具有極性黏度大外表張力大性質(zhì)不穩(wěn)定一〕發(fā)酵液的預(yù)處置1、目的：發(fā)酵液中雜質(zhì)多且成分復(fù)雜，其中對純化影響最大的是高價(jià)無機(jī)離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等改動發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡能夠使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處置的相中；〔普通為液相〕可以除去部分雜質(zhì)。2、高價(jià)無機(jī)離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時(shí)，可用草酸鈉取代；草酸價(jià)錢較高，消費(fèi)上普通需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子構(gòu)成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子構(gòu)成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+3、可溶性雜蛋白的去除雜蛋白的存在會降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會發(fā)生乳化，影響兩相分別。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時(shí)，還會使濾速下降，使膜遭到污染。1〕沉淀法調(diào)等電點(diǎn)因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍(pH4.0-5.5)但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等構(gòu)成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等構(gòu)成沉淀2〕變性法變性蛋白溶解度較小最常用加熱法加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；其他方法：大幅度調(diào)理pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或外表活性劑變性法存在一定的局限如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需耗費(fèi)大量酸堿，而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處置的液體數(shù)量較少的場所。3〕吸附法參與某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去如四環(huán)素消費(fèi)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，參與氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去凝聚和絮凝都是發(fā)酵液預(yù)處置的重要方法，其處置過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改動細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等粒子的分散形狀，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分別的絮凝體，再進(jìn)展分別。

發(fā)酵液預(yù)處置的方法—凝聚和絮凝凝聚指在投加的化學(xué)物質(zhì)〔如水解的凝聚劑：鋁、鐵的鹽類或石灰等〕作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。電解質(zhì)的凝聚才干可用凝聚值表示，即使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度〔mmol/L〕。普通反離子的價(jià)數(shù)越高，凝聚值越小，即凝聚才干越強(qiáng)。如Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

絮凝指運(yùn)用絮凝劑〔通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)〕將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，構(gòu)成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用，工業(yè)上運(yùn)用到的有聚丙烯酰胺類衍生物、聚合鋁鹽、海藻酸鈉、殼聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺類衍生物。1〕板框(plateandframe)壓濾機(jī)板框過濾機(jī)構(gòu)造圖1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓安裝二〕發(fā)酵液過濾常用設(shè)備板框過濾機(jī)

Plateshifter1500x1500FilterPressClothwashing1〕板框(plateandframe)壓濾機(jī)2〕帶式壓濾機(jī)二〕發(fā)酵液過濾常用設(shè)備發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)展補(bǔ)料，防止消泡劑和未用完的培育基添加過濾難度；菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物添加發(fā)酵液黏度影響發(fā)酵液過濾的要素1〕菌體細(xì)胞體積真菌菌絲體較粗大，發(fā)酵液不需特殊處置，易過濾；放線菌菌絲細(xì)而分支，交錯成網(wǎng)格狀，較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處置，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，提高過濾速度；細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處置，很難用常規(guī)過濾設(shè)備進(jìn)展過濾操作。2〕培育基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會添加過濾難度3〕放罐時(shí)機(jī)當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時(shí)，會使發(fā)酵液的黏度增大而影響過濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。提高過濾性能的方法1〕加助濾劑助濾劑是一種不可緊縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而添加濾速；常用硅藻土、珍珠巖等；參與方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑參與發(fā)酵液中。2〕添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3〕酶解法〔沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶〕發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分別細(xì)胞破碎細(xì)胞分別高度純化廢品加工預(yù)處置胞外產(chǎn)物〔加熱、調(diào)pH、絮凝〕〔過濾、離心分別、膜分別)〔勻漿、研磨、酶解〕〔離心分別、雙水相萃取、膜分別〕〔重結(jié)晶、離子交換、色譜分別、膜分別〕〔濃縮、無菌過濾、枯燥、成型〕胞內(nèi)產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。細(xì)胞破碎目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)胞內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成的包含體是不分泌的，故需進(jìn)展細(xì)胞破碎。大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法；利用高壓使細(xì)胞懸液經(jīng)過針型閥，由于忽然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)，呵斥細(xì)胞破碎。影響破碎的主要要素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)1〕高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2〕高速球磨法高速球磨機(jī)1-物料進(jìn)口2-物料出口3、4-冷卻水進(jìn)、出口5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速攪拌或研磨，使細(xì)胞得以破碎。3〕超聲波法常用超聲波頻率15-25kHz；原理：由于超聲波產(chǎn)生極為劇烈的沖擊波壓力，引起黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上呵斥了剪切力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，呵斥細(xì)胞破碎；超聲波振蕩易引起溫度的猛烈上升，操作時(shí)需冷卻；通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4〕酶解法專注性強(qiáng)，條件溫暖；但費(fèi)用較高酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解本身細(xì)胞壁的酶；當(dāng)改動一定的環(huán)境條件，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶景象。5〕浸透壓沖擊法將細(xì)胞先放入高浸透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在到達(dá)平衡后，介質(zhì)忽然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，水就會迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂；此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處置的，或細(xì)胞壁合成遭到抑制的微生物；6〕反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞反復(fù)在低溫下忽然冷凍后在室溫下融化，引起細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵構(gòu)造斷裂，從而添加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞忽然膨脹而破裂。該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞細(xì)胞破碎方法二、提取〔初步分別〕〔一〕沉淀法〔Precipitation〕沉淀是經(jīng)過改動條件或參與某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。方法簡單、本錢低、運(yùn)用廣泛，初步分別的常用手段。鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法生成鹽復(fù)合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法中性鹽的參與能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而析出。1.鹽析法(Saltingout)破壞了蛋白質(zhì)在水中存在的兩個(gè)要素(水化層和電荷),從而使蛋白質(zhì)沉淀。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子〔如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水〞，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶景象〔比在純水中的溶解度大大添加〕；高鹽濃度那么鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)理混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

1〕蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分別的蛋白質(zhì)經(jīng)常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一同沉淀出來〔共沉景象〕。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。2〕離子強(qiáng)度和種類3〕溫度溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要要素，升高溫度可以添加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；4〕pH由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH影響鹽析的要素2.等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在電中性時(shí)溶解度最低優(yōu)點(diǎn)：許多蛋白的等電點(diǎn)都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無機(jī)酸的價(jià)錢低廉；缺陷：酸化時(shí)易引起蛋白失活不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會發(fā)生等電點(diǎn)偏移，如胰島素的等電點(diǎn)為5.3，在與Zn2+結(jié)合構(gòu)成胰島素鋅鹽，其等電點(diǎn)升為6.2；故參與金屬離子后選擇等電點(diǎn)沉淀時(shí)，要留意調(diào)整pH。二、提取〔初步分別〕〔二〕結(jié)晶法〔crystallization〕物質(zhì)從液態(tài)〔液體或熔融體〕或氣態(tài)構(gòu)成晶體的過程叫結(jié)晶。參與能使結(jié)晶溶質(zhì)溶解度降低的物質(zhì)，讓結(jié)晶溶質(zhì)構(gòu)成過飽和液；例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脫色液中參與終濃度為60%-80%的乙醇，就結(jié)晶析出;在普魯卡因青霉素結(jié)晶時(shí)，參與一定量的食鹽，可使結(jié)晶更易析出結(jié)晶方法〔過飽和溶液構(gòu)成的方法〕1〕濃縮結(jié)晶減壓蒸發(fā)濃縮，到達(dá)過飽和2〕冷卻結(jié)晶適用于溶解度隨溫度變化很大的物質(zhì)；先加熱使其溶解，然后冷卻結(jié)晶；3〕化學(xué)反響結(jié)晶參與反響劑或調(diào)pH，使生成更低可溶性物質(zhì)；如在青霉素醋酸丁酯提取液中，參與乙醇-醋酸鉀，因構(gòu)成的青霉素鉀鹽難溶于醋酸丁酯而結(jié)晶析出。4〕解析結(jié)晶〔drowningout〕三、精制〔高度純化〕〔一〕離子交換法(Ionexchange)離子交換任務(wù)原理根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子不同，電荷不同的物質(zhì)對層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改動洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，不同物質(zhì)就能依次從層析柱中分別出來。在離子交換過程中，離子首先分散到樹脂外表，經(jīng)過樹脂分散到交換位置，在交換位置進(jìn)展離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹脂的結(jié)合越嚴(yán)密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子分散到樹脂外表，洗脫液經(jīng)過，被交換的離子分散到外部溶液中。三、精制〔高度純化〕〔二〕色譜分別法用微量注射器針頭或微細(xì)管把樣品點(diǎn)一小點(diǎn)在層