結(jié)構(gòu)生物學(xué)等

構(gòu)造生物學(xué)的研討方法和技術(shù)生物大分子要發(fā)揚(yáng)功能，必需滿足兩個(gè)條件:第一，凡要發(fā)揚(yáng)功能和活性的生物大分子必需具有特定的，本身特有，相對(duì)穩(wěn)定的三級(jí)構(gòu)造;第二，構(gòu)造運(yùn)動(dòng)。任何的破壞促使沒有穩(wěn)定的三級(jí)構(gòu)造和構(gòu)造運(yùn)動(dòng)，生物大分子是很難發(fā)揚(yáng)生物功能或活性的。構(gòu)造生物學(xué)概念及主要研討方法構(gòu)造生物學(xué)是經(jīng)過確定生物大分子三級(jí)構(gòu)造，來研討生物大分子的構(gòu)造功能關(guān)系，從而討論生物大分子的作用機(jī)制和原理作為研討目的。主要研討方法:X-射線晶體衍射方法〔X-射線蛋白質(zhì)晶體學(xué)〕多維核磁共振〔NMR〕電鏡晶體學(xué)和電鏡三維重組方法構(gòu)造生物學(xué)的開展60年代當(dāng)時(shí)的開文迪許實(shí)驗(yàn)室的M.PerutzJ.Kendrew用X-射線晶體衍射技術(shù)獲得了球蛋白的構(gòu)造.由于X射線晶體衍射技術(shù)的運(yùn)用，使我們可以在晶體程度研討大分子的構(gòu)造，在分子原子根底上解釋了大分子.由于他們開創(chuàng)性的任務(wù)，Waston,Crick獲得了1962年的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),M.Perutz和J.Kendrew獲得了同年的化學(xué)獎(jiǎng).從那時(shí)起，技術(shù)的開展就成為構(gòu)造生物學(xué)開展最重要的決議要素。來源：1950s,Waston,Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋構(gòu)造，建立DNA的雙螺旋模型。60-70年代,在同一實(shí)驗(yàn)室的他們又開展了電子晶體學(xué)技術(shù)，當(dāng)時(shí)的研討對(duì)象主要是有序的,對(duì)稱性高的生物體系，如二維的晶體和對(duì)稱性很高的三維晶體。70-80年代，多維核磁共振波譜學(xué)的發(fā)明使得在水溶液中研討生物大分子成為能夠,水溶液中的生物大分子更接近于生理形狀.80年代到本世紀(jì)初,冷凍電子顯微鏡的發(fā)明,這種技術(shù)的發(fā)明使我們不僅可以研討生物大分子在晶體形狀和溶液形狀的構(gòu)造，而且可以研討研討復(fù)雜的大分子體系超分子體系，這就是細(xì)胞器和細(xì)胞.可見構(gòu)造生物學(xué)的開展過程閱歷了從結(jié)晶到溶液再到大分子體系,超分子體系,如核糖體(ribosome),病毒,溶酶體(lysosome),線粒體等.

X-射線晶體衍射方法X射線單晶衍射技術(shù)是由H.W.布拉格和W.L.布拉格父子于1912年提出和開展起來的.此技術(shù)最先用于無機(jī)晶體分析,后來到1953年,沃森和克里克用于DNA晶體分析,至60年代,肯德魯和佩魯茲用于研討血紅蛋白和肌紅蛋白,逐漸成為生物大分子晶體構(gòu)造研討的重要手段,直至今天仍占據(jù)統(tǒng)治位置。優(yōu)點(diǎn)是分辨率高,到達(dá)原子分辨率,既可研討水溶性蛋白、也可研討膜蛋白和大分子組裝體與復(fù)合體。它能給出生物大分子的分子構(gòu)造和構(gòu)型,確定活性中心的位置和構(gòu)造,從分子程度了解蛋白質(zhì)如何識(shí)別和結(jié)合客體分子,如何催化,如何折疊和進(jìn)化等生命的根本過程,進(jìn)而闡明生命景象。如1997年底,運(yùn)用X射線單晶衍射方法完成了有關(guān)核小體(nucleosome)的中心顆粒分辨率為0128nm的精細(xì)空間構(gòu)造的測(cè)定,每個(gè)核小體的盤狀中心含有8個(gè)組蛋白構(gòu)成的八面體、外繞146個(gè)堿基對(duì)組成的DNA,這一出色的成就對(duì)了解基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制與修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程都很重要.此外,運(yùn)用X射線單晶衍射技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)和核酸的晶體構(gòu)造并結(jié)合分子模擬技術(shù),曾經(jīng)為新藥物的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)全新的方向,大大縮短了新藥的研制過程.新藥的設(shè)計(jì)和開發(fā),要求對(duì)這些藥物靶標(biāo)(drugtarget)的構(gòu)造、性能有準(zhǔn)確的了解,由于迄今對(duì)其了解甚少,現(xiàn)有臨床藥物絕大多數(shù)是經(jīng)過嘗試挑選獲得的,導(dǎo)致研制一個(gè)新藥經(jīng)常需十多年,甚至幾十年的時(shí)間.經(jīng)過對(duì)愛滋病病毒(HIV)蛋白酶的精細(xì)構(gòu)造測(cè)定,并以此為靶標(biāo)設(shè)計(jì)酶的抑制劑作為治療愛滋病的有效藥物獲得宏大勝利,已顯著減少愛滋病死亡數(shù)量.X-ray測(cè)定生物大分子構(gòu)造的原理為什么要用X-射線d假設(shè)原子的尺度為dl>>dl≤d只需光源波長(zhǎng)與妨礙物尺度相當(dāng)，或者光源波長(zhǎng)小于妨礙物尺度的時(shí)候才干探測(cè)到妨礙物的信息。X-射線的波長(zhǎng)與原子以及化學(xué)鍵的尺度相當(dāng)，都在?的數(shù)量級(jí)。因此可以被用來探測(cè)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的構(gòu)造。X-rayProteinCrystal為什么要用衍射把光源換成X射線把透鏡換成X射線透鏡到目前為止人類還沒有發(fā)現(xiàn)什么方法可以讓X-射線發(fā)生折射。所以當(dāng)前只能經(jīng)過衍射這種不那么直觀的方法來研討蛋白質(zhì)分子內(nèi)部構(gòu)造。什么是晶體晶體在宏觀上呈現(xiàn)出規(guī)那么的幾何外形NaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaCl二維陳列三維堆積晶體是一種具有長(zhǎng)程、三維分子有序的固體。小孔光柵衍射圖樣如何根據(jù)衍射結(jié)果解析蛋白質(zhì)構(gòu)造參考f(x)=Acos(2px–a)上式也可表示為：r為電子密度，xyz為實(shí)空間坐標(biāo)V為晶胞體積|F(hkl)|2=I(hkl)，I代表衍射點(diǎn)的強(qiáng)度，hkl為衍射點(diǎn)坐標(biāo)a代表初始相角hkf(x)=Acos(2px–a)a=0x12340a=p/2x12340a=-px1234000對(duì)于一束X-射線f(x)=Acos(2px–a)來說，無論它的初始相角是多少，它在接納屏上所構(gòu)成的曝光點(diǎn)都是一樣的。反之，我們只根據(jù)接納屏上的曝光點(diǎn)也是無法得知呵斥該曝光點(diǎn)的X-射線的初始相角信息的。初始相角無法直接丈量得到，但它又是求解電子密度時(shí)所必需的信息。這就是X-射線晶體衍射法解析物質(zhì)構(gòu)造時(shí)所需求處理的中心問題——相位〔相角〕問題。處理相位問題的方法：同晶置換法最原始的方法，包括多對(duì)同晶置換法和單對(duì)同晶置換法。需求在蛋白質(zhì)晶體中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶體與未引入重原子的晶體的晶型根本一樣。解析過程需求未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多顆晶體的多套衍射數(shù)據(jù)。反常散射法包括多波長(zhǎng)反常散射法和單波長(zhǎng)反常散射法。通常需求引入具有較強(qiáng)反常散射才干的原子，如硒原子。不需求多顆晶體但往往需求同一顆晶體在不同波長(zhǎng)X-射線照射下的多套衍射數(shù)據(jù)。隨著技術(shù)的提高，目前蛋白質(zhì)本身的硫原子也開場(chǎng)被用來作為反常散射源。分子置換法需求同源性較高的蛋白質(zhì)分子構(gòu)造模型，不需求多顆晶體，不需求多套衍射數(shù)據(jù)，方便快捷，但不能用來解析全新的構(gòu)造。主要技術(shù)流程圖蛋白質(zhì)結(jié)晶的必要條件蛋白質(zhì)分子必需均一〔純化〕均一的蛋白質(zhì)分子不均一〔不純〕的蛋白質(zhì)分子沉淀劑的作用沉淀未飽和成核區(qū)過飽和區(qū)蛋白質(zhì)濃度沉淀劑濃度獲得蛋白質(zhì)晶體的方法由于蛋白質(zhì)分子體積大，分子外表情況復(fù)雜，極性不明顯，分子間作用力弱等緣由，蛋白質(zhì)分子在到達(dá)過飽和的時(shí)候不容易有序陳列構(gòu)成晶體，而是容易隨機(jī)聚合構(gòu)成沉淀。因此需求針對(duì)不同蛋白質(zhì)挑選各自的結(jié)晶條件。蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)：整批結(jié)晶法液液分散法透析法氣相分散法a.懸滴法b.座滴法懸滴法1ml蛋白溶液1ml結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液池座滴法1ml蛋白溶液1ml結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液池?zé)o論是懸滴法還是座滴法，當(dāng)?shù)竭_(dá)蒸汽平衡的時(shí)候，蛋白質(zhì)所在液滴里的結(jié)晶溶液組分的濃度將會(huì)接近于池液的濃度。結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液成分：沉淀劑通常為不同分子量的聚乙二醇或者高濃度的硫酸銨、氯化鈉等。輔助分子通常為低濃度的鹽pH緩沖劑例如：HamptonResearchCrystalScreenKit#140.2MCaCl20.1MHEPESpH7.528%(v/v)PEG400Detergentsandadditives結(jié)晶條件的優(yōu)化最初挑選得到的結(jié)晶條件往往不是該蛋白的最正確結(jié)晶條件。此時(shí)的蛋白質(zhì)晶體往往衍射才干很差，甚至沒有衍射。因此普通來說還需求對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件進(jìn)展優(yōu)化。優(yōu)化的方法就是把結(jié)晶溶液中的沉淀劑、輔助分子，結(jié)晶時(shí)的蛋白質(zhì)濃度在原濃度附近做一個(gè)梯度；相應(yīng)地，結(jié)晶溶液中的pH值也要在原值附近做一個(gè)梯度。在把這些梯度陳列組合起來，從而找出一個(gè)最正確的結(jié)晶條件。優(yōu)化前優(yōu)化后衍射實(shí)例缺陷：樣品必需為晶體〔單晶〕,但生物大分子結(jié)晶困難,特別是膜蛋白和病毒等分子組裝體結(jié)晶更是困難.其次對(duì)于像病毒那樣大的分子組裝體,丈量其精細(xì)構(gòu)造非常復(fù)雜.緣由有二:一是大晶胞含有的原子極多,X射線衍射點(diǎn)極多,經(jīng)常無法區(qū)分、識(shí)別和探測(cè);其二是大晶胞所產(chǎn)生的衍射點(diǎn)強(qiáng)度過弱,特別在高分辨時(shí),無法與背景區(qū)分.NMR也是測(cè)定生物大分子構(gòu)造重要手段根本原理：核磁共振景象(nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR)1946年由哈佛大學(xué)的伯塞(E.M.Purcell)和斯坦福大學(xué)的布洛赫(F.Bloch)所指點(diǎn)的2個(gè)小組,用不同的方法在各自的實(shí)驗(yàn)室里察看到的,伯塞爾運(yùn)用的實(shí)驗(yàn)方法是吸收法,而布洛赫運(yùn)用的是感應(yīng)法.利用物理原理,經(jīng)過對(duì)核磁共振譜線特征參數(shù)的測(cè)定來分析物質(zhì)的分子構(gòu)造與性質(zhì)。NMR不破壞被測(cè)樣品的內(nèi)部構(gòu)造，是一種無損檢測(cè)方法。由于不同的原子核吸收不同的電磁波，因此經(jīng)過測(cè)定和分析受測(cè)物質(zhì)對(duì)電磁波的吸收情況就可以斷定它含有哪種原子，原子之間的間隔有多大，并據(jù)此分析出它的三維構(gòu)造。以蛋白質(zhì)為例,它的二級(jí)構(gòu)造如α螺旋,β折疊、轉(zhuǎn)角、環(huán)形和卷曲等,表達(dá)了蛋白質(zhì)分子主鏈原子在三維空間各種不同的陳列規(guī)律性.位于不同二級(jí)構(gòu)造域的原子核間距,原子核間的相互作用以及多肽段的動(dòng)態(tài)特性,都直接反映蛋白質(zhì)三維構(gòu)造的特征.這些具有不同構(gòu)造特征的原子核間距、肽鍵二面角、肽鍵的動(dòng)態(tài)特性等都具有特征的核磁共振譜線.因此,我們分析核磁共振譜就可以獲得蛋白質(zhì)的三維構(gòu)造.1H,13C,15N是核磁共振檢測(cè)的主要對(duì)象,各有不同的共振頻率,從而構(gòu)成核磁共振氫譜、碳譜和氮譜三部分.核磁共振

(NuclearMagneticResonance-NMR)在水溶液中,大約有一半的蛋白質(zhì)鏈呈現(xiàn)出規(guī)那么、嚴(yán)密的三維構(gòu)造,而另一半那么非常松。目前,科學(xué)家曾經(jīng)利用這一方法繪制出15%～20%的知蛋白質(zhì)的構(gòu)造。最初,核磁共振技術(shù)主要用于核物理研討方面,用它丈量各種原子核的磁矩,誤差僅是0.003%～0.005%;迄今,它已廣泛運(yùn)用于化學(xué)、食品、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域,已成為在這些領(lǐng)域開展研討任務(wù)的有力工具,甚至是某些領(lǐng)域(如:化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物學(xué)等)常規(guī)分析中不可短少的手段。1985年,維特里希(KurtWüthrich〕等人公布了第一次利用NMR法測(cè)定的溶液中蛋白質(zhì)-蛋白酶抑制劑IIA(proteinaseinhibitorIIA)的構(gòu)造(如圖4所示)。1990年用NMR測(cè)定的蛋白質(zhì)構(gòu)造有23個(gè),而到1994年一年測(cè)定的蛋白質(zhì)構(gòu)造數(shù)上升到100個(gè)。1997年,維特里希運(yùn)用NMR方法測(cè)定的一種蛋白質(zhì)-蛋白感染素(prionprotein)的構(gòu)造。核磁共振方法的最大特點(diǎn)是可以直接在溶液中測(cè)定自然形狀下的大分子三維空間構(gòu)造，其分辨率已接近012nm,但由于大分子量的生物分子的核磁共振圖譜非常復(fù)雜,難以解釋,因此它只能丈量分子量較小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可測(cè)定35kDa的生物分子;其次在測(cè)定中要求樣品是高純度且數(shù)量相對(duì)較多,使樣品制備亦有困難;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物樣品,對(duì)膜蛋白或病毒等的組裝體、復(fù)合體就無法測(cè)定.另一種方法稱為冷凍電鏡計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)方法或單顆粒技術(shù)〔Cryo-EM〕.特點(diǎn):急速冷凍(103-104℃Ps)樣品懸液,樣品被包埋在無定形的非晶態(tài)冰薄膜中,這樣既不損傷樣品,又可使樣品堅(jiān)持著自然形狀,因此樣品制備簡(jiǎn)單。缺陷：分辨率稍低.研討的病毒樣品,目前分辨率接近0.17nm,估計(jì)這幾年內(nèi)可達(dá)0.14nm.核糖體可達(dá)1.10nm,而離子通道可達(dá)2.10nm.由于運(yùn)用冷凍電鏡與計(jì)算機(jī)重構(gòu)技術(shù)研討病毒三維構(gòu)造所需樣品制備簡(jiǎn)單,對(duì)病毒的大小沒有限制,使其開展很快,至今已有100多個(gè)病毒的三維構(gòu)造被冷凍電鏡計(jì)算機(jī)重構(gòu)方法所闡明,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越X射線晶體學(xué)的30-40種病毒的數(shù)量.雖然其分辨率還有待提高,但所提供的資料和數(shù)據(jù)對(duì)于生命科學(xué)的許多研討來說,曾經(jīng)是非常珍貴和重要的根據(jù),甚至曾經(jīng)滿足了某些研討的要求.假設(shè)把這種研討方法與用X射線單晶衍射所獲得的病毒衣殼高分辨三維構(gòu)造結(jié)合起來那就更有意義了.冷凍電鏡計(jì)算機(jī)重構(gòu)方法雖然其開展歷史較晚,但特別有利于病毒、核糖體、離子通道等大的復(fù)合體、組裝體等的構(gòu)造與功能的研討,是構(gòu)造生物學(xué)的新開展方向.這些研討既是構(gòu)造生物學(xué)的重要內(nèi)容,又是正在走向綜合的重要一步.Cryo-EMstructureofprokaryotic30STranslationInitiationComplex3.6-AngstromcryoEMstructureofhumanadenovirustyp