微生物限度檢查及控制

微生物限制檢驗及控制王旭2021教程目的GMP檢查中常見的缺陷微生物限制檢查的定義微生物限制檢查的樣品處置微生物限制檢查用培育基及其靈敏度檢查微生物限制檢查方法和驗證1－GMP檢查中常見的缺陷XXX止咳糖漿中含有防腐劑，但廢品的微生物限制檢驗操作規(guī)程未嚴厲按照2000年版<中國藥典>的要求制定，未思索到防腐劑對實驗的影響，檢驗方法不合理。純化水微生物限制檢測方法未驗證，實踐檢測方法不合理，樣品被稀釋了1660倍后再用直接接種法進展檢測。微生物限制檢查的原始記錄短少所用培育基的稱號、配制批號。注射用水、純化水檢測中，未按2005版藥典要求進展霉菌和酵母菌數(shù)的檢驗。2.定義測定一切藥用資料〔從原料到廢品〕中需氧微生物的數(shù)量的方法。證明一切藥用資料〔從原料到廢品〕中無特定微生物的方法。3.取樣及樣品處置我們期望什么?在整批產(chǎn)品中特定微生物的數(shù)量。我們做的是什么測試?限制是一個破壞性的實驗–我們不能對整批進展100%檢驗。如何經(jīng)過檢驗來證明整批產(chǎn)品的微生物數(shù)量？要求有一個取樣方案來涵蓋整個批號。有足夠的取樣量和檢驗量無抑菌要素如何對批進展取樣？樣品必需具有批代表性：最易污染的位置取樣：批開場、終了及艱苦缺點和調整后延續(xù)性隨機性上述取樣過程要有文件規(guī)定和記錄3.1取樣及樣品處置_取樣方案取多少樣〔檢驗數(shù)量〕?藥典規(guī)定檢定量是：10克或10毫升同時要思索檢驗損耗和復試3.2取樣及樣品處置_取樣量目的溶解：防止讀數(shù)時的干擾勻質：保證檢驗量消除抑菌要素：提高檢驗靈敏度3.3取樣及樣品處置_供試液的制備方法:10ml/g樣品，加無菌氯化鈉－蛋白胨至100ml,1小時內運用3.3取樣及樣品處置_供試液的制備無抑菌性水溶性液體樣品：無需處置無抑菌性油性液體樣品：加聚山梨酯20、80;乳濁液〔<45℃,<30min〕無抑菌性非水溶性固體體樣品：碾磨懸濁,加聚山梨酯80助溶具抑菌活性的供試品：稀釋、中和、洗、沖要有一個完好的取樣方案涵蓋整個批消費過程，并要思索到“最壞情況〞以提高檢出能夠性。檢驗數(shù)量和檢驗量應滿足藥典要求。樣品處置消除干擾、提高靈敏度3.4取樣及樣品處置_結論我們期望什么?在整批產(chǎn)品中特定微生物的數(shù)量。我們做的是什么測試?微生物限制檢查是經(jīng)過目檢計數(shù)微生物在培育基上生長的菌落數(shù)來判別結果。如何經(jīng)過檢驗來證明整批產(chǎn)品的微生物數(shù)量〔負載〕？能支持微生物生長并無菌_培育基的靈敏度檢查。培育基的保管控制無抑制微生物生長的要素存在_方法驗證實驗4.微生物限制檢查用培育基細菌：營養(yǎng)瓊脂培育基，30-35℃，培育48小時。霉菌：玫瑰紅鈉瓊脂培育基，23-28℃，培育72小時。酵母：酵母浸出粉胨培育基，23-28℃，培育72小時4.1微生物限制檢查用培育基4.2微生物限制檢查用培育基_靈敏度檢查一切培育基必需無菌〔陰性對照〕配制后用閱歷證的方法滅菌經(jīng)過陰性對照每次實驗進展控制用代表菌平皿法證明培育基靈敏度－回收率>70%。藥典無要求檢查頻率：每次滅菌批〔至少滅菌參數(shù)變卦后4.3微生物限制檢查用培育基_保管應規(guī)定保管有效期:在密閉容器中一年，非密閉容器中一月2-25°保管確保pH在密閉容器中保管運用三種微生物培育基有效控制微生物培育基的保管和效期4.4微生物限制檢查用培育基_結論5.微生物限制檢查方法藥典規(guī)定兩種方法:平皿法:加1ml樣品制備液至無菌平皿中，倒15-20ml,<45℃培育基混勻倒置培育。至少制備2個平板?？刂凭鋽?shù)在30-100CFU〔細菌〕，30-80CFU〔真菌〕薄膜過濾法：制備液用0.45m膜過濾并用3x100ml無菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上貼與培育基上。每種培育基制備一張膜控制菌落數(shù)<100CFU/膜假設樣品本身的混濁，會干擾計數(shù)結果要思索對樣品中抑菌要素進展中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接種量限制，實驗靈敏度受局限操作簡便，設備要求低5.1微生物限制檢查方法_平皿法操作復雜，設備要求高不適用于無法溶解的樣品大體積檢驗量，檢驗靈敏度不受局限樣品中的抑菌要素可被濾除中和試劑可運用在淋洗液中，如：?-內酰胺酶分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯5.2微生物限制檢查方法_薄膜過濾法兩種方法的共同點:-培育基和培育溫度-培育時間-任務環(huán)境：100級區(qū)域進展〔普通是要求與消費的干凈條件一致〕5.3微生物限制檢查方法TSB培育基中增菌培育2天金葡菌：劃線甘露醇氯化鈉瓊脂30－35℃，培育1天。革蘭氏染色顯微察看。－無陽性球菌大腸、沙門和綠膿：劃線麥康凱瓊脂30－35℃，培育1天，革蘭氏染色顯微察看。－無陰性桿菌控制菌檢查:5.4微生物限制檢查方法方法驗證實驗_證明在實驗條件下沒有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，外表活性劑，…以下情況應進展重新驗證：檢驗方法變卦培育基變卦〔包括，滅菌參數(shù)變卦〕產(chǎn)品處方變卦菌種：大腸、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌5.5微生物限制檢查方法_方法驗證方法驗證實驗_證明在實驗條件下沒有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，外表活性劑，…以下情況應進展重新驗證：檢驗方法變卦培育基變卦〔包括，滅菌參數(shù)變卦〕產(chǎn)品處方變卦挑戰(zhàn)菌液：大腸、金葡、枯草，稀釋至50-100cfu/ml待用白念、黑曲霉，稀釋至30-80cfu/ml待用5.5微生物限制檢查方法_方法驗證驗證方法：實驗組：挑戰(zhàn)菌液＋樣品制備后進展實驗供試品對照組：樣品制備后進展實驗菌液組：挑戰(zhàn)菌液進展實驗空白對照組：直接用稀釋液進展實驗5.5微生物限制檢查方法_方法驗證驗證合格規(guī)范細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)實驗空白對照組無菌生長菌液組無雜菌生長〔實驗組－供試品對照組〕÷菌液組70％控制菌檢查實驗空白對照組無菌生長菌液組無雜菌生長對實驗組的菌落鑒定，確認是所接種挑戰(zhàn)菌株5.5微生物限制檢查方法_方法驗證報告：〔平均計數(shù)×稀釋倍數(shù)〕假設在1:10稀釋樣品中沒有檢出，報告<10cfu/g(ml)假設平均值有小數(shù)，應取整數(shù)后乘稀釋倍數(shù)，例如：1:10稀釋樣品：平板1:1cfu;平板2：0cfu;平均為0.5報告結果是10cfu/ml,而不是5cfu/ml5.6微生物限制檢查方法_結果判別結論:有三種檢驗方法，但所用培育基、培育溫度、時間一樣檢驗方法應驗證證明，在實驗條件下沒有抑菌效應5.7微生物限制檢查方法_結論培育基:細菌:大豆胰蛋白瓊脂，30-35℃，培育48小時霉菌酵母：沙氏葡萄糖，20-25℃，培育5天6.微生物限制檢查_USP引見美國藥典：多管法6.微生物限制檢查_USP引見稀釋度管1管2管3空白1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1：101ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基A:1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1：1001mlA＋9ml培養(yǎng)基1mlA＋9ml培養(yǎng)基1mlA＋9ml培養(yǎng)基B：1mlA＋9ml培養(yǎng)基1：10001mlB＋9ml培養(yǎng)基1mlB＋9ml培養(yǎng)基1mlB＋9ml培養(yǎng)基中國藥典中對控制菌檢查有類似方法要思索對樣品中抑菌要素進展中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接種量限制，實驗靈敏度受局限操作復雜，設備要求高適用于無法溶解的樣品6.微生物限制檢查_USP引見美國藥典