一文掌握“小鼠葡萄糖代謝”相關(guān)試驗(yàn)要點(diǎn)

一文掌握“小鼠葡萄糖代謝”相關(guān)試驗(yàn)要點(diǎn)肥胖是造成代謝紊亂如「胰島素抵抗」的常見(jiàn)危險(xiǎn)因素，對(duì)于肥胖的研究，最常見(jiàn)的動(dòng)物模型就是60%高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肥胖，此模型與臨床肥胖癥的病理相似，穩(wěn)定性好，10周左右就可以看到明顯的表型。表型出現(xiàn)后，除了測(cè)量體重之外，更需要衡量的就是體內(nèi)胰島素抵抗水平和葡萄糖耐量，通俗來(lái)說(shuō)就是機(jī)體對(duì)葡萄糖分解代謝的能力，這個(gè)時(shí)候我們可以外源性地給小鼠葡萄糖后來(lái)監(jiān)測(cè)一定時(shí)間段內(nèi)的血糖情況，也就是葡萄糖耐量檢測(cè)，如果是通過(guò)口服給予葡萄糖，就是口服糖耐量試驗(yàn)(「oralglucosetolerancetestj)簡(jiǎn)稱為：「OGTT」；如果是通過(guò)腹腔注射來(lái)給予葡萄糖，就是經(jīng)腹腔注射葡萄糖耐量檢測(cè)(fintraperitonealglucosetolerancetestj)簡(jiǎn)稱為「IPGTTJ如果葡萄糖耐量降低，機(jī)體消耗葡萄糖的能力下降，在外源給予葡萄糖之后，血糖相對(duì)迅速上升而下降緩慢。在臨床上，這個(gè)實(shí)驗(yàn)也十分普遍，當(dāng)然，臨床中是通過(guò)口服葡萄糖來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這個(gè)試驗(yàn)也是臨床診斷糖尿病的金標(biāo)準(zhǔn)。相反地，如果外源給予胰島素，檢測(cè)特定時(shí)間段內(nèi)的血糖水平，就是胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(「insulintolerancetest,insulin-inducedhypoglycemiatestj)簡(jiǎn)稱為「ITTJ,而外源性胰島素的給予方式，是通過(guò)腹腔注射來(lái)實(shí)現(xiàn)的；如果出現(xiàn)了胰島素不敏感，在注射胰島素之后，血糖相對(duì)下降緩慢而上升較快?？傊?，OGTT和ITT是兩個(gè)評(píng)價(jià)代謝狀態(tài)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，兩者分別評(píng)估了葡萄糖耐量和胰島素抵抗的情況，如果葡萄糖是經(jīng)過(guò)腹腔給予的，那么就是IPGTT試驗(yàn)，本質(zhì)上和OGTT是一樣的。理清了OGTT和ITT的基本概念之后，我們分別看看兩者是具體怎么實(shí)現(xiàn)的首先我們來(lái)了解一下OGTT試驗(yàn)如何實(shí)施。大體上來(lái)講，小鼠的OGTT試驗(yàn)就是在小鼠空腹12-16小時(shí)后給予適量水平的葡萄糖后，選擇6個(gè)常規(guī)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)血糖的過(guò)程。小鼠血糖如何測(cè)量？給予葡萄糖的量是多少？6個(gè)時(shí)間點(diǎn)如何選擇？多只小鼠同時(shí)進(jìn)行如何協(xié)調(diào)？都是我們需要注意的問(wèn)題。小鼠準(zhǔn)備我們?nèi)⊙耐緩绞菑男∈笪膊揩@得，在正式進(jìn)行OGTT試驗(yàn)前的一周，可以進(jìn)行小鼠「掐尾適應(yīng)訓(xùn)練」，這樣小鼠在正式實(shí)驗(yàn)時(shí)能夠從容面對(duì)，從而避免應(yīng)激性的高血糖。在正式試驗(yàn)的前一天，給小鼠換上干凈的墊料，饑餓14小時(shí)（比如前一天晚上的18:00正式開(kāi)始饑餓，次日早上8:00開(kāi)始實(shí)驗(yàn)）。葡萄糖的準(zhǔn)備準(zhǔn)備10毫升左右的20%的葡萄糖，一定要注意是試劑級(jí)別的葡萄糖以及溶解葡萄糖的雙蒸水是無(wú)菌的。小鼠稱體重根據(jù)體重計(jì)算葡萄糖溶液的用量，常用劑量是1g/kg，如果一只小鼠重30g,那么需要給它準(zhǔn)備150ul的葡萄糖了。同時(shí)保證小鼠標(biāo)號(hào)清楚，同時(shí)進(jìn)行多只小鼠的OGTT實(shí)驗(yàn)，時(shí)間的管理就尤為重要，不要在識(shí)別小鼠上面浪費(fèi)時(shí)間。小鼠取血和基礎(chǔ)血糖檢側(cè)尾尖剪去1-2mm，棄掉第一滴，用第二滴檢測(cè)血糖；動(dòng)作輕柔，避免應(yīng)激性的高血糖，同時(shí)也可以用小刀劃口子取血，血糖的檢測(cè)只需要3ul，如果利用毛細(xì)管引流，可以收集到30ul,可以用于其他指標(biāo)的測(cè)量。圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)給予葡萄糖根據(jù)計(jì)算的葡萄糖的體積，通過(guò)灌胃或腹腔注射給小鼠相應(yīng)劑量的葡萄糖，在灌胃的過(guò)程中一旦遇到任何阻力，不要強(qiáng)行灌注，極有可能誤入了氣管，此時(shí)應(yīng)該退出灌胃針，重新進(jìn)針。當(dāng)?shù)谝恢恍∈蠊辔赋晒?，按下?jì)時(shí)器倒計(jì)時(shí)15分鐘，在此期間應(yīng)保證所有小鼠都灌胃成功，如果按照一只小鼠1分鐘操作時(shí)間計(jì)算得話，同一批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的小鼠不要超過(guò)15只。保證在計(jì)時(shí)器響起得那一刻，第一只被灌胃的小鼠可以進(jìn)行第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)也就是15分鐘的血糖測(cè)量。圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)其余時(shí)間點(diǎn)得血糖監(jiān)測(cè)重復(fù)上面的步驟，在30,60,90,120min的時(shí)間點(diǎn)分別監(jiān)測(cè)血糖，時(shí)間點(diǎn)可以自己設(shè)置，如果選擇180min或者更長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)，那么，應(yīng)該保證小鼠在此期間有足夠的飲水；實(shí)驗(yàn)吉束小鼠放回籠子，保證充足的飲水和食物，小鼠的OGTT實(shí)驗(yàn)對(duì)與它的消耗是很大的，所以，如果要再次進(jìn)行OGTT或者進(jìn)行ITT試驗(yàn)得話，應(yīng)該保證至少一周的間隔時(shí)間。其次我們?cè)賮?lái)了解一下小鼠的ITT試驗(yàn)基本要點(diǎn)和OGTT實(shí)驗(yàn)相似，不同的是，胰島素是通過(guò)腹腔注射給予的，并且饑餓時(shí)間應(yīng)該縮短至2-5h，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的饑餓容易發(fā)生小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的低血糖休克，所以為了避免這樣的情況發(fā)生，掌握好胰島素的劑量就顯得非常重要，常用劑量為0.75U/Kg，同時(shí)提前準(zhǔn)備好20%的葡萄糖，一旦發(fā)生低血糖休克，立即灌胃葡萄糖進(jìn)行搶救。圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)時(shí)間點(diǎn)的選擇上，推薦15,30,60,90,120min,再長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)得檢測(cè)是沒(méi)有意義的，因?yàn)橐葝u素的半衰期只有10分鐘，超出2小時(shí)后血糖水平與胰島素就沒(méi)有關(guān)系了。最后，我們應(yīng)該對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并進(jìn)行繪圖呈現(xiàn)出來(lái)，典型的結(jié)果如下圖，分別是OGTT（左）和ITT（右）的結(jié)果圖，分別是高脂飲食組（60%脂肪）HFD和低脂飲食組（10%脂肪）LFD組，每組30只;左圖是在在過(guò)夜禁食之后，灌胃給予葡萄糖（1g/Kg）后的15,30,45,60分鐘后檢測(cè)血糖水平，我們可以看到高脂飲食組血糖迅速上升且幅度較大，而下降相對(duì)緩慢，說(shuō)明出現(xiàn)了葡萄糖耐量減退；右圖是空腹?fàn)顟B(tài)的小鼠給予腹腔注射胰島素（0.75U/Kg）后的15,30,45,60分鐘的血糖水平，可以看出高脂飲食組血糖下降減慢而且幅度較低，說(shuō)明出現(xiàn)了胰島素抵抗。圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)OGTT和ITT是衡量代謝的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，值得我們學(xué)習(xí)和掌握。參考文獻(xiàn)：StudyofInVivoGlucoseMetabolisminHigh-fatDie